一、DNA電泳相關(guān)：

1、DNA電泳緩沖液：

（1）Tris-乙酸（TAE）緩沖液：TAE較為常用，且價(jià)格低搪花，但其緩沖能力較弱。所以TAE電泳需要蠕動(dòng)泵使兩極貯液槽進(jìn)行液體循環(huán)嘹害，而且TAE需要經(jīng)常更新撮竿；且要加入EDTA，目的在于鰲合二價(jià)離子笔呀，抑制DNase幢踏，以保護(hù)DNA。

①?TAE使用液：

1×：40mmol/L ?Tris-乙酸

1mmol/L ? EDTA

②?TAE貯存液（每L）：

50×：242g ????Tris堿

57.1ml ??冰乙酸

100ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0）

（2）Tris-硼酸（TBE）緩沖液：

①?TBE使用液：

0.5×：0.045mol/L ?Tris-硼酸

1mmol/L ??? EDTA

②?TBE貯存液（每L）：

5×：?54g ????Tris堿

27.5ml ??硼酸

20ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0）

（3）Tris-磷酸（TPE）緩沖液：

①?TPE使用液：

1×：90mmol/L ?Tris-磷酸

2mmol/L ? EDTA

②?TPE貯存液（每L）：

10×：108g ????Tris堿

15.5ml ??85%磷酸

40ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0）

2凿可、1%（線性DNA分子大小為400-6000）瓊脂糖凝膠DNA電泳操作過(guò)程：

①制膠：按要求取1g瓊脂糖加入1×TAE（或0.5×TAE）電泳緩沖液100ml惑折，置于三角瓶中，在沸水浴或微波爐中加熱至瓊脂糖溶解（一般中低火溫枯跑，3-5min即可）惨驶；

②溶液冷卻至60℃，加入EB至0.5μg/ml（2-3ml即可）,充分混勻敛助；

③迅速倒入備好的膠模中粗卜；

④凝膠完全凝固后，小心移去梳子和封口膠帶纳击，將凝膠放入電泳槽中续扔；

⑤加入能沒過(guò)膠面1mm深的電泳緩沖液（TAE）攻臀；

⑥D(zhuǎn)NA樣品與加樣緩沖液（溴酚藍(lán)）混合后，用微量移液吸頭加樣纱昧；

⑦蓋上電泳槽并通電刨啸，使DNA向正極移動(dòng)（黑極→紅極），1-5V/cm（80V電壓左右）進(jìn)行電泳（30min左右）识脆；

⑧電泳完畢设联，切斷電源，取出凝膠于紫外投射光源下觀察并拍照灼捂。

二离例、12％SDS-PAGE?的相關(guān)溶液

1、5×加樣緩沖液：

10% w/v SDS悉稠，10 mM DTT或β-巰基乙醇宫蛆，20% v/v甘油，0.2M Tris-HCl pH 6.8的猛，0.05% w/v?溴酚藍(lán)耀盗。??（注意：將不含DTT的1×SDS凝膠上樣緩沖液置于室溫下儲(chǔ)存，臨用前從1mol/L DTT儲(chǔ)液中添加到上述緩沖液中衰絮。）

5×Sample Buffer：

10% w/v SDS

10 mmol/L Dithiothreitol,or beta-mercapto-ethanol

20% v/v Glycerol ?

0.2 mol/L Tris-HCl pH 6.8

0.05% w/v Bromophenolblue

另：2×SDS?上樣液緩沖液:

100mL溶液中含0.5mol/L Tris-HCl(pH=6.8) 20mL , SDS 4 g ,甘油20 mL ,?溴酚藍(lán)0.2 g ,DTT3g;

2袍冷、1×電泳緩沖液：

25 mM Tris-HCl pH 8.8磷醋，200 mM?甘氨酸猫牡，0.1% w/vSDS。

1×Running Buffer

25mmol/L Tris-HCl pH 8.8

200～250mmol/L ???Glycine（電泳級(jí)）（pH 8.3）

0.1% w/v SDS

可以配成5×貯存液邓线，在900ml去離子水中溶解15.1gTris堿和94g甘氨酸淌友，然后加入50ml 10%（m/v）電泳級(jí)SDS的貯存液，用去離子水補(bǔ)至1000ml即可骇陈。

3震庭、分離膠配方：

H2O 10.5，1.5 M Tris-HCl pH8.8 ?7.5你雌，20% w/v SDS 0.15器联，30%?丙烯酰胺?/ 0.8%?亞甲雙丙烯酰胺(/w/v) ?12.0，10% w/v?過(guò)硫酸銨?15婿崭，TEMED ?0.02（單位：mL拨拓，總體積25 mL）。注：過(guò)硫酸銨會(huì)緩慢分解氓栈，故應(yīng)每周新鮮配制渣磷，可用去離子水配制少量10%（m/v）儲(chǔ)存液于4℃保存。

Running Gel Solution (mL)?：

H2O ??????????????????????????????????????????????10.2

1.5 mol/L Tris-HCl pH8.8 ?????????????????????????????7.5

20% SDS (w/v) ????????????????????????????????????0.15

Acrylamide/Bis-acrylamide (30%/0.8% w/v)?12.0

10% ammonium persulfate (w/v)?0.15

TEMED 0.02

4授瘦、積層膠配方(4%?丙烯酰胺)：

H2O 3.05醋界，0.5 M Tris-HCl pH6.8 1.25竟宋，20% w/v SDS 0.025，30%?丙烯酰胺?/ 0.8%?亞甲雙丙烯酰胺(/w/v) 0.65形纺，10% w/v過(guò)硫酸銨?0.025丘侠，TEMED 0.005（單位：mL，總體積5 mL）逐样。

Stacking Gel Solution (4% Acrylamide) (mL)：

H2O ????????????????????????????????????????????????3.075

0.5 mol/L Tris-HCl pH6.8 ??????????????????????????????1.25

20% SDS (w/v) ??????????????????????????????????????0.025

Acrylamide/Bis-acrylamide (30%/0.8% w/v)?0.67

10% ammonium persulfate (w/v)?0.025

TEMED 0.005

5婉陷、考馬斯亮藍(lán)染色液：

0.25 g考馬斯亮藍(lán)R250溶解于90 mL甲醇：水（1:1 v/v）和10 mL冰乙酸的混合液中，過(guò)濾除去顆粒狀物質(zhì)官研。（或考馬斯亮藍(lán)R-250 0.5g ,乙醇250mL ,乙酸110mL ,水740mL ,混勻;）

另：0.2％考馬斯亮蘭R-250染液：

甲醇?????????????????????????????? 46.5ml

醋酸?????????????????????????????? 7.0ml

考馬斯亮蘭???????????????????????? 0.2g

蒸餾水???????????? ????????????????加至100ml

6秽澳、脫色液：

170 mL甲醇,加70 mL冰乙酸，加蒸餾水定容至1000 mL戏羽。

三担神、蛋白質(zhì)純化的相關(guān)溶液

1、超聲破菌緩沖液：

20mmol/L Tris-HCl pH8.0始花、0.5mol/L NaCl妄讯、1mmol/L EDTA、1mg/mL溶菌酶

2酷宵、包涵體洗滌緩沖液：

20 mmol/L Tris－HCl pH 8.0亥贸，0.5 mol/L NaCl，2 mol/L尿素浇垦，2％?Triton炕置。?

3、包涵體溶解緩沖液：

20 mmol/L Tris－HCl pH 8.0男韧，0.5 mol/L NaCl朴摊，8 mol/L尿素，0.2 mmol/L DTT或100 mmol/L β-巰基乙醇此虑，2％Triton甚纲。

4、Ni2+親和層析柱純化緩沖液：

格式變形朦前，參考“生命科學(xué)技術(shù)摘集”

結(jié)合緩沖液（pH7.8）：

20mmol/L?磷酸鈉

500mmol/L NaCl

洗滌緩沖液（pH6.0）：

20mmol/L磷酸鈉

500mmol/LNaCl

咪唑洗脫緩沖液（pH6.0）：

20mmol/L?磷酸鈉

500mmol/L NaCl

在洗滌緩沖液（pH6.0）中加入適量3mol/L咪唑分別配成10mmol/L介杆、50mmol/L?、100mmol/L和150 mmol/L的咪唑洗脫緩沖液韭寸。

Triton X-100(10% v/v)

酶和緩沖液：

DNase(1mg/ml)

溶菌酶

RNase(1mg/ml)

5春哨、2％Triton X－100溶液：

?量取2mlTriton X一100(聚乙二醇辛基苯基醚)液，加M緩沖液98ml即可棒仍。

6悲靴、50％PEG(聚乙二醇Polyethyleneglycol mwl500)：

稱取0.5克PEG，用前放入試管中在酒精燈火焰上熔化，加入等量37℃予熱的MEM培養(yǎng)液癞尚，混勻耸三，保溫在37℃水浴中待用。

7浇揩、1％SDS(十二烷基硫酸鈉Sodium dodecyl sulfate,SDS)：?

?SDS???????????????????????????????? 10g

?45％乙醇??????????????????????????? 100ml

8仪壮、1mol/LTris(三羥甲基氨基甲烷/鹽酸緩沖液Trihydroxy methylaminomethane Tris/HCL)pH7.8：

Tris???????????????????????????????? 12.114g

蒸餾水????????????????? ?????????????lOOml

先將Tris溶于少量蒸餾水，用HCI調(diào)pH至7.8胳徽，然后加水至100ml

四积锅、PH緩沖液的配制：

（1）磷酸緩沖鹽溶液（PBS）：

①??137mmol/L NaCl

2.7mmol/L KCl

10mmol/L Na2HPO4

2mmol/L KH2PO4

用800ml蒸餾水溶解8g NaCl，0.2g KCl养盗，1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4缚陷。用HCl調(diào)節(jié)溶液的PH值至7.4，加水至1L往核。分裝后在15psi（1.05kg/cm2）高壓蒸汽滅菌20min箫爷，或過(guò)濾除菌，保存于室溫聂儒。（注：PBS是一種通用試劑虎锚，值得指出的是上述列出的配方缺乏雙價(jià)陽(yáng)離子，如果需要衩婚，PBS可以補(bǔ)加成1mmol/L CaCl2和0.5mmol/L MgCl2）

②?0.01mol／LPBS(磷酸鹽緩沖液Phosphate Buffer Saline窜护，PBS)，pH7.2：

A：0.2mol／L磷酸氫二鈉液(甲液)：?

NaH2PO4·12H2O?????????????????????? 35.814g

雙蒸水?加至500ml

B：0.2mol／L磷酸二氫鈉液(乙液):

NaH2PO4·2H2O?????????????????????? 15.601g

雙蒸水?加至500ml

取甲液36ml非春，乙液14ml和NaCl 8.2克柱徙，加雙蒸水至1000ml∷澳龋混勻待完全溶解分裝坐搔，經(jīng)高壓滅菌后保存于4℃冰箱備用藏研。

③?1/15 mol/L PBS(磷酸緩沖液Phosphate Buffer Solution敬矩，PBS)：

甲液：1/15 mol/L Na2HPO4溶液

Na2HPO49.465g

蒸餾水??????????????????加至1000ml

乙液：l/15 mol/L KH2PO4溶液

KH2P049.07g

蒸餾水??????????????????加至1000m1

分裝在棕色瓶?jī)?nèi)，于4℃冰箱中保存蠢挡，用時(shí)甲弧岳、乙兩液各按不同比例混合，即可得所需pH的緩沖液,見下表:

格式變形业踏，參考“生命科學(xué)技術(shù)摘集”

（2）10×Tris EDTA(TE):

①pH 7.4:

100mmol/L Tris-Cl(pH7.4)

10mmol/L EDTA(pH8.0)

②pH 7.6:

100mmol/L Tris-Cl(pH7.6)

10mmol/L EDTA(pH8.0)

③pH 8.0:

100mmol/L Tris-Cl(pH8.0)

10mmol/L EDTA(pH8.0)

分裝后在15psi（1.05kg/cm2）高壓蒸汽滅菌20min禽炬，保存于室溫。

（3）Tris-Cl（1mol/L）:

用800ml蒸餾水溶解121.1gTris堿勤家，加濃鹽酸調(diào)pH?至所需值腹尖。

pH ????????????HCl

7.4 ???????????70ml

7.6 ???????????60ml

8.0 ???????????42ml

應(yīng)使溶液冷至室溫后，方可最后調(diào)定pH?值伐脖。加水定容至1L热幔。分裝后高壓蒸汽滅菌乐设。如果1mol/L溶液呈現(xiàn)黃色，應(yīng)予丟棄绎巨。并使用質(zhì)量更好的Tris近尚。Tris溶液的pH?值因溫度而異，溫度每升高1℃场勤，pH?值大約降低0.03單位戈锻，0.05mol/L溶液在5℃，25℃和37℃時(shí)的pH?值分別為9.5和媳，8.9和8.6格遭。

（4）Tris緩沖鹽溶液（TBS）：

用800ml蒸餾水溶解8g NaCl，0.2g KCl和3g Tris堿留瞳，加入0.015g酚紅并用HCl調(diào)pH值至7.4如庭，用蒸餾水定容至1L。分裝后在15 psi（1.05 kg/cm2）高壓下蒸汽滅菌20min撼港，保存于室溫坪它。

五、常用緩沖液配制：

（1）碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液

貯備液A：0.2 mol/L碳酸鈉（Na2CO3·H2O 24.8g配成1000ml）帝牡；

貯備液B：0.2 mol/L碳酸氫鈉（NaHCO3?16.8g配成1000ml）往毡。

x ml A液?+ y ml B液稀釋至200ml

格式變形，參考“生命科學(xué)技術(shù)摘集”

（2）磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液

貯備液A：0.2 mol/L磷酸二氫鈉（NaH2PO3·H2O 27.6g或NaH2PO3·2H2O 31.21g配成1000ml）靶溜；

貯備液B：0.2 mol/L磷酸氫二鈉（Na2HPO3·2H2O 35.61g或Na2HPO3·12H2O 71.64g配成1000ml）开瞭。

x ml A液?+ y ml B液稀釋至100ml

格式變形，參考“生命科學(xué)技術(shù)摘集”

（3）Tris-HCl緩沖液

貯備液A：0.2 mol/L三羥甲氨基烷（Tris-ydroxy methyLamino methanne,C4H11NO3罩息，24.2g配成1000ml）嗤详；

貯備液B：0.2 mol/L鹽酸（濃HCl?17.1ml配成1000ml）。

50ml ml A液?+ x ml B液稀釋至200ml

格式變形瓷炮，參考“生命科學(xué)技術(shù)摘集”

（4）檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液

貯備液A：0.1 mol/L檸檬酸（C6H8O7葱色，19.21g配成1000ml）；

貯備液B：0.1 mol/L檸檬酸鈉（C6H5O7Na3·2H2O 29.41g配成1000ml）娘香。

x ml A液?+ y ml B液稀釋至100ml

格式變形苍狰，參考“生命科學(xué)技術(shù)摘集”

（5）醋酸-醋酸鈉緩沖液

貯備液A：0.2 mol/L醋酸（冰醋酸11.55ml稀釋至1000ml）；

貯備液B：0.2 mol/L醋酸鈉（C2H2O2Na 16.4g或C2H2O2Na·3H2O 27g配成1000ml）烘绽。

x ml A液?+ y ml B液稀釋至1000ml

格式變形淋昭，參考“生命科學(xué)技術(shù)摘集”

六、細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞融合溶液：

1安接、0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA混合消化液：

胰蛋白酶(Trypsin)粉???????????????? 0.25g

EDTA粉???????????????????????????? 20.0mg

0.01mol／L PBS????????????????????? 100ml

先用少量PBS溶解胰蛋白酶翔忽，然后將EDTA粉末和剩下的液體加入混合，置37℃水浴中1小時(shí)左右(待徹底溶解，液體呈透明為止)歇式，用G5抽濾矢赁，分裝置4℃冰箱中保存。

2贬丛、Hanks液：

（1）原液

①原液甲：

??NaCl???????????????????????????????? 160g

??KCl?????????? ????????????????????????8g

MgSO4·7H2O???????????????????? 2g

MgCI2·6H2O???????????????????????2g

??溶于800ml餾水中撩银。

CaCl2(無(wú)水)????????????????????????2.8g

??溶于100ml蒸餾水中。

??將兩種液體混合后豺憔，加水至1000ml用濾紙濾過(guò)额获，再加2ml氯仿防腐，置4℃冰箱備用恭应。

②原液乙：

Na2HPO4·12H2O??? ???????????????3.04g

KH2PO41.2g

??葡萄糖?????????????????????????????????20.0g

??溶于800ml蒸餾水中抄邀，用濾紙過(guò)濾，然后加0.5％酚紅80ml昼榛，再加水至1000ml境肾，最后加入2ml氯仿防腐，置4℃冰箱備用胆屿。

（2）使用液

甲乙兩液各1份奥喻，雙蒸水18份，混勻分裝包扎好瓶口非迹，經(jīng)10磅15分鐘高壓滅菌后置4℃冰箱中保存环鲤。使用時(shí)用5.6％NaHCO3調(diào)pH值到所需要求。

3憎兽、LB培養(yǎng)基（Luria-Bertani培養(yǎng)基）：

每升培養(yǎng)基含有：

細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨（bacto-trytone）??????????10g

細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物（bacto-yeast extract）??????5g

氯化鈉（NaCl）??????????????????????????????10g

在950ml重蒸水中分別加入上述組分冷离，搖動(dòng)容器直至溶質(zhì)完全溶解，用5mol/L氫氧化鈉（NaOH）（約0.2ml）調(diào)節(jié)pH值至7.0纯命，加入重蒸水定容至1L西剥，在1.034×105Pa高壓蒸汽滅菌20min。（液體培養(yǎng)基）

另：固體培養(yǎng)基（含有瓊脂或瓊脂糖的培養(yǎng)基）

按照上述配方配制液體培養(yǎng)基亿汞，高壓滅菌前加入下列試劑中的一份：

細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂（Bacto-Agar）??????15g/L(鋪制平板用)

細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂（Bacto-Agar）??????7g/L(配制頂層瓊脂用)

瓊脂糖????????????????????????????15g/L(鋪制平板用)

瓊脂糖????????????????????????????7g/L(配制頂層瓊脂用)

在15psi（1.05kg/cm2）高壓下滅菌20min瞭空。從高壓鍋取出培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)輕輕旋動(dòng)以使溶解的瓊脂或瓊脂糖能夠均勻分布在整個(gè)培養(yǎng)基溶液中。必須小心留夜，此時(shí)培養(yǎng)基溶液可能過(guò)熱匙铡，旋動(dòng)液體可能會(huì)發(fā)生暴沸。應(yīng)使培養(yǎng)基降溫至50～60℃碍粥，方可加入不耐熱的物質(zhì)（如抗生素，加Amp的量為1:100）黑毅；為避免產(chǎn)生氣泡嚼摩，混勻培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)采用旋動(dòng)的方式。然后可直接從燒瓶中倒置平板。90mm直徑的培養(yǎng)皿每個(gè)需約30～50ml的培養(yǎng)基枕面。如果平板上的培養(yǎng)基有氣泡形成愿卒，可在瓊脂或瓊脂糖凝結(jié)前用本生煤氣噴射燈灼燒培養(yǎng)基表面以除去之。設(shè)定顏色記號(hào)在相應(yīng)平板的邊緣作記號(hào)以區(qū)別不同的培養(yǎng)基潮秘。

培養(yǎng)基完全凝固后琼开，應(yīng)倒置平板并貯存于4℃?zhèn)溆谩Ｊ褂们?-2h應(yīng)取出貯存的平板枕荞。如果平板是新鮮配制的嗅绰，在37℃溫育時(shí)會(huì)“發(fā)汗”挣跋，便會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌菌落或噬菌體噬菌斑在平板表面擴(kuò)散而增加交叉污染的機(jī)會(huì)。為避免這一問題，可以拭去平皿內(nèi)部的冷凝水并把平板倒置谍夭，37℃溫育數(shù)小時(shí)方予使用，也可以快甩一下平皿以除去冷凝水趴泌，為盡可能減少污染倒戏，除去蓋上的水滴時(shí)，應(yīng)把開蓋的平板呈倒置狀態(tài)拿著瞭吃。

4碌嘀、Amp：抗生素（氨芐青霉素），濃度50mg/ml（溶于水）歪架，溫度-20℃筏餐，工作液（嚴(yán)密型質(zhì)粒：20μg/ml；松弛型質(zhì)粒60μg/ml）

5牡拇、IPTG：isopropyl-β-D-thiogalactoside(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)魁瞪，作為蛋白質(zhì)誘導(dǎo)劑。母液1M/L惠呼，工作液1mM/L