今天军洼，分享一篇浙大樊老師和華大發(fā)表在Developmental Cell 上的，題目是“Spatiotemporal transcriptomic landscape of rice embryonic cells during seed germination”的文章。這個(gè)paper里利用單細(xì)胞和華大stereo-seq構(gòu)建了水稻種胚的空間轉(zhuǎn)錄圖譜。
=====實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)=====
基于水分吸收和生理變化，作者把水稻種子吸脹之后的萌發(fā)分為三個(gè)階段：0-24揖曾、24-48、48-72小時(shí)（HAI）亥啦。其中轉(zhuǎn)錄變化最顯著的發(fā)生在0-24和24-48 HAI。所以作者取樣的話练链，取了4個(gè)時(shí)間點(diǎn)：6翔脱、24、36媒鼓、48 HAI届吁。
=========結(jié)果==========
結(jié)果1：產(chǎn)生了水稻種胚的高質(zhì)量單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)
基于華大的stereo-seq收集了4個(gè)切片中的52個(gè)種胚組織切片错妖，并利用華大可視化系統(tǒng)STOmics進(jìn)行展示，用戶可以通過他們的網(wǎng)址進(jìn)行訪問：http://ibi.zju.edu.cn/REGSTA/疚沐。
4個(gè)芯片上每個(gè)bin50上包含大約1200 UMI暂氯，平均基因數(shù)目為583個(gè)。為了避免不同時(shí)間點(diǎn)之間/采樣之間的批次效應(yīng)亮蛔，作者最后從52個(gè)切片中選取了14個(gè)切片（分別來自6痴施、24、36和48 HAI的4究流、4辣吃、3、3）進(jìn)行后續(xù)的分析（附圖1A）芬探。
同時(shí)作者神得，還對4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的樣品進(jìn)行了單細(xì)胞測序（圖1A），總共獲得了27099個(gè)細(xì)胞偷仿。過濾之后哩簿，獲得了27070個(gè)細(xì)胞，包含37458個(gè)基因酝静。從單細(xì)胞數(shù)據(jù)和空轉(zhuǎn)數(shù)據(jù)的相關(guān)性來看节榜，大概在0.5左右，可能主要是由于在原生質(zhì)體準(zhǔn)備過程中酶切造成的（附圖1B）形入。
總的來說全跨，作者從14個(gè)切片4個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣本中獲得了高質(zhì)量的空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，同時(shí)獲得了包含27070個(gè)細(xì)胞的單細(xì)胞數(shù)據(jù)亿遂，使得作者可以去探索在水稻發(fā)芽過程中的時(shí)空轉(zhuǎn)錄規(guī)律浓若。
結(jié)果2：水稻胚乳的細(xì)胞自動分割
為了有效捕獲每個(gè)cell的RNA，作者構(gòu)建了一個(gè)自動化的胚乳細(xì)胞分割流程蛇数。作者首先使用FB染色技術(shù)可視化細(xì)胞壁挪钓。為了評估細(xì)胞分割的準(zhǔn)確性，作者創(chuàng)建了一個(gè)具有清晰細(xì)胞壁染色信息的圖像集作為訓(xùn)練數(shù)據(jù)耳舅。然后通過一些參數(shù)碌上，比如DICE指數(shù)、預(yù)測和實(shí)際之間的面積浦徊，來平復(fù)細(xì)胞切割模型的準(zhǔn)確性（圖1B）馏予。在測試的幾個(gè)模型中，CP_embryo具有最高的準(zhǔn)確性（圖1C盔性，1D）霞丧。和以往的bin模型（窗口模型）相比，作者這個(gè)流程可以檢測出更多的cell冕香，每個(gè)cell中有較少的基因數(shù)目蛹尝。
并且后豫，作者發(fā)現(xiàn)，使用細(xì)胞分割法突那，有助于減輕組織空隙對數(shù)據(jù)結(jié)果的影響挫酿。例如空隙中基因的表達(dá)和環(huán)境更為相似，而不是其它組織區(qū)域（圖1E）愕难。同時(shí)早龟，細(xì)胞分割方法更有助于查看不同區(qū)域細(xì)胞尺寸的差異，因?yàn)樗九呷橹械募?xì)胞尺寸差異較大务漩。例如SCL2是最大的細(xì)胞拄衰，直徑大約30mm，而PL和RA的細(xì)胞最小饵骨，直徑僅僅為10um翘悉。而通過bin50方法發(fā)現(xiàn)PL區(qū)域的cell數(shù)目為9.2個(gè)，SC區(qū)域的cell數(shù)目為0.88居触⊙欤考慮到不同細(xì)胞的尺寸，每個(gè)bin的大小大概為25um轮洋，bin方法只能作為參考而已制市。
結(jié)果3：空間聚類以及細(xì)胞類型分類
根據(jù)組織學(xué)上的特征以及空間信息，作者把水稻的胚乳分成了5個(gè)區(qū)域（PL弊予、RA祥楣、CO、SC和EP-CR）（圖2A）汉柒。作者首先用Seurat進(jìn)行了無監(jiān)督空間聚類误褪，以24 HAI的樣品為例，基于bin聚類后碾褂，獲得了13個(gè)不同細(xì)胞簇（圖2A）兽间。然后把這些簇映射到空間信息上，5個(gè)區(qū)域可以被分成13個(gè)細(xì)胞類型：PL正塌、COL1嘀略，COL），RA乓诽，RAL3帜羊，EPCR，EP-CRL）鸠天，LS逮壁，SCL1，SCL2，SCL1-2窥淆、SCL3，以及BESCL2巍杈。從空間分布來看忧饭，細(xì)胞類型和空間位置還是比較一致的（圖2A）。根據(jù)以往其它胚乳切片的信息筷畦，還多一個(gè)細(xì)胞類型RC（root cap）词裤，所以總共有14個(gè)細(xì)胞類型。作者推斷RC應(yīng)該在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)都存在的鳖宾，但是由于截面角度問題吼砂，并不是所有時(shí)間點(diǎn)都能看到RC的結(jié)構(gòu)。
基于作者建立的細(xì)胞分割流程鼎文，也基于無監(jiān)督的方法進(jìn)行了聚類和注釋渔肩，并和bin的方法進(jìn)行了比較。細(xì)胞分割方法總共捕獲了5693個(gè)細(xì)胞拇惋，遠(yuǎn)高于bin方法的2398（圖2B）周偎。每個(gè)細(xì)胞平均檢測的基因數(shù)目則是bin方法高于細(xì)胞分割，分別是649和163撑帖∪乜玻基于聚類的分割方法，可以鑒定出上面13個(gè)細(xì)胞類型的9個(gè)（圖2A）胡嘿。這些結(jié)果表明蛉艾，這兩種方法都可以用于細(xì)胞類型的鑒定≈缘校基于Bin方法勿侯，不同細(xì)胞類型之間的reads數(shù)量有明顯的差異。而基于細(xì)胞分割方法逢享，則沒有明顯的差異罐监。
為了確保細(xì)胞類型注釋的準(zhǔn)確性，作者驗(yàn)證了一些以往報(bào)道過的marker基因瞒爬，例如qLTG3-1弓柱，已知在CR和EP區(qū)域表達(dá)。此外侧但，通過不同細(xì)胞類型的差異分析矢空，作者鑒定了不同細(xì)胞類型許多新的標(biāo)記基因（圖2C）。并通過 ISH驗(yàn)證了部分基因（圖2D）禀横。
作者發(fā)現(xiàn)LTP不同member具有細(xì)胞類型特異表達(dá)的特征屁药。例如，OsLTP1.15和OsLTP1.2柏锄，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂酿箭，在PL中特異表達(dá)复亏；OsLTP2.6主要在COL2中表達(dá)；OsHyPRP14/20是特異性的在EP-CR中表達(dá)缭嫡。原位雜交（FISH）也證明OsHyPRP14在EP-CR區(qū)域中特異性且高度表達(dá)（圖S2D）缔御。OsLTP1.18、LTP妇蛀、OsLTPG22耕突，參與種子脂質(zhì)的存儲，主要在COL1中表達(dá)评架。這些結(jié)果表明不同的LTP通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝在不同的細(xì)胞類型中發(fā)揮著不同的作用（圖2E）眷茁。
有一些基因則在胚乳的特定細(xì)胞類型表達(dá)。例如OsLEA20纵诞， 編碼一種晚期胚胎發(fā)生豐富的（LEA）蛋白上祈，在RA中特異表達(dá)（圖2E）。長鏈脂肪酸編碼基因ONI1挣磨，與芽發(fā)育有關(guān)雇逞，在COL1中具有特定的表達(dá)模式。此外茁裙，一個(gè)同源基因CER1（OsCER1）塘砸，調(diào)節(jié)花藥發(fā)育和水稻質(zhì)體分化，在發(fā)芽胚胎的PL中特異表達(dá)晤锥。GO富集結(jié)果表明掉蔬，“DNA包復(fù)合體”等途徑（p=4.39E 4）和“染色質(zhì)的組裝或拆卸”（p＝2.19E4）在PL中富集，這意味著PL具有比較高的增殖能力矾瘾。
結(jié)果4：SC區(qū)域細(xì)胞分裂和分化軌跡構(gòu)建
從作者的分類來看女轿，SC區(qū)域可以分成5個(gè)細(xì)胞類型（SCL1、SCL1-2壕翩、SCL1-3
SCL2蛉迹、BESCL1-2和SCL3）。通過marker基因放妈，作者鑒定了SCL1和SCL3（圖3A）北救。編碼半胱氨酸蛋白酶OsSAG12-1和α淀粉酶糖蛋白AMY1A在SCL1中特異表達(dá)（圖3B）。SCL3代表SC中的維管束組織芜抒，由于切片的角度問題珍策，這種細(xì)胞類型很難識別，作者幸運(yùn)的在一些切片中看到這個(gè)類型（圖3A）宅倒。有幾個(gè)marker基因攘宙，比如SRZ1，編碼鋅指蛋白和SAMDC1，編碼
S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶在SCL3中特異表達(dá)（圖2C）蹭劈。
除了已知的SCL1和SCL3之外疗绣，空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明還存在其它三種細(xì)胞類型，既SCL1-2铺韧、SCL2和BESCL2持痰。SCL2包含多種薄壁細(xì)胞層，位于PL附近祟蚀。作者也鑒定了SCL2中特異表達(dá)的基因，如Os11g0496500和OsMFT2割卖，并用FISH驗(yàn)證了OsMFT2（圖3C）前酿。以往報(bào)道證明OsMFT2通過調(diào)控ABA合成來影響種子的萌發(fā)。時(shí)間序列的空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)也表明OsMFT2從6到48 HAI的表達(dá)逐漸降低鹏溯。對比野生型罢维，OsMFT2敲除株系的發(fā)芽率顯著升高（圖3D），既達(dá)到30%的發(fā)芽率敲除株系種子需要30小時(shí)丙挽，而WT則需要96小時(shí)肺孵。這一結(jié)果表明OsMFT2降低了種子的休眠時(shí)間。和RNA-seq的聯(lián)合分析表明在敲除株系中SCL2的比例明顯小于野生型（圖3E）颜阐。這個(gè)結(jié)果說明OsMFT2是SCL2區(qū)域的一個(gè)特異基因平窘。
從解剖圖來看，BESCL2和SCL2面積明顯大于SCL1-2凳怨。BESCL2主要在SCL2的兩端瑰艘。SCL1-2主要在SCL1和SCL2中間。作者用marker基因OsCYS9驗(yàn)證了這一結(jié)果（圖3B）肤舞。
為了更好的解析這三類細(xì)胞類型的功能紫新，作者整合單細(xì)胞數(shù)據(jù)構(gòu)建了其發(fā)育軌跡（圖3F），同時(shí)鑒定了發(fā)育軌跡上關(guān)鍵的差異基因（圖3G）李剖。從結(jié)果可以看出芒率，早期的細(xì)胞類型主要是SCL1-2，主要是肽合成相關(guān)的基因篙顺。在中間狀態(tài)的主要是種子成熟以及乙醛裂解酶活性相關(guān)的基因偶芍。隨后，余環(huán)境響應(yīng)相關(guān)的額基因開始富集慰安，主要在BESCL2細(xì)胞腋寨。
結(jié)果5：水稻種子萌發(fā)過程中的動態(tài)轉(zhuǎn)錄響應(yīng)
作者接下來探索6、24化焕、36萄窜、48不同時(shí)間點(diǎn)之間的動態(tài)差異。無監(jiān)督聚類表明在所有的樣本中有著相似的細(xì)胞類型構(gòu)成（圖4A），除了BESCL2查刻、SCL3和EP-CRL1在6 HAI的樣本中區(qū)分不開键兜，RAL3在24-HAI樣品中沒有識別之外。不同重復(fù)之間的細(xì)胞比例沒有明顯差別穗泵，說明取樣的穩(wěn)定性普气。通過比較不同時(shí)間點(diǎn)之間的細(xì)胞比例，作者發(fā)現(xiàn)SCL2佃延、RA现诀、COL1、COL2有顯著的變化（圖4B）履肃。隨著時(shí)間推移仔沿，SCL2和LS的比例顯著下降，而RA的比例則顯著上升尺棋。
作者進(jìn)一步使用Mfuzz的對不同細(xì)胞類型的4個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行聚類封锉，并鑒定了不同時(shí)間點(diǎn)的marker基因（圖4C）。與細(xì)胞壁組成膘螟、微管相關(guān)的途徑成福、氣孔發(fā)育、芽系統(tǒng)形態(tài)發(fā)生荆残、表皮形態(tài)發(fā)生的途徑在萌發(fā)過程中持續(xù)升高（圖4C）奴艾。溫度和水的響應(yīng)、陽離子結(jié)合和葉綠體包膜特征等相關(guān)的基因從6到24HAI劇烈下降脊阴，隨后不變握侧。細(xì)胞周期、ATP酶活性和有絲分裂和DNA修復(fù)相關(guān)的基因從36-HAI開始升高嘿期，這些結(jié)果意味中從36-HAI開始細(xì)胞增值和細(xì)胞周期開始加強(qiáng)品擎。
結(jié)果6：激素以及營養(yǎng)的細(xì)胞類型特異調(diào)控
在水稻種子萌發(fā)的過程中植物激素調(diào)節(jié)了營養(yǎng)代謝。通過結(jié)合空轉(zhuǎn)和單細(xì)胞數(shù)據(jù)备徐，作者發(fā)現(xiàn)生長素和GA以及脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的基因從6-48時(shí)間點(diǎn)逐漸升高萄传。而ABA則是顯著下降。淀粉酶基因則是從6到36上升蜜猾，然后下降（圖5A）秀菱。這些結(jié)果和種胚萌發(fā)過程的RNA-seq的結(jié)果是一致的〔渌空轉(zhuǎn)數(shù)據(jù)使得我們可以探索不同細(xì)胞類型響應(yīng)的差異衍菱。淀粉酶基因主要在SCL1和SCL-2中表達(dá)（圖5B和5C）。通過查看激素信號肩豁，作者發(fā)現(xiàn)auxin合成相關(guān)的基因主要在PL和RA中高表達(dá)脊串。而通過查看轉(zhuǎn)錄因子的情況辫呻，發(fā)現(xiàn)幾個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族（NAC、LBD琼锋、HSF等）在PL和RA中特異表達(dá)放闺，并且和auxin的pattern相反。GA主要在LS和EP-CR中高表達(dá)（圖5B）缕坎。
