??Loss of function和gain of function是基因功能研究的最重要手段。傳統(tǒng)上鲁僚，我們僅針對(duì)一個(gè)或者幾個(gè)基因進(jìn)行操作，以達(dá)到基因功能缺失或者獲得的目的裁厅。更大規(guī)模地批量進(jìn)行基因操作與功能分析是靶向篩選目標(biāo)基因的更有效手段冰沙。RNAi Screening就是一種專門用于基因功能缺失的大規(guī)模功能篩選策略；而隨著CRISPR/Cas9的發(fā)展执虹，基于Cas9以及CRISPRi和CRISPRa的篩選策略也被開發(fā)出來拓挥，并廣泛用于耐藥基因篩選，功能基因研究等袋励。以針對(duì)基因的敲除的CRISPR Screening為例侥啤，可以針對(duì)全基因組所有基因進(jìn)行sgRNA的設(shè)計(jì)，從而進(jìn)行基因敲除茬故。理想情況下盖灸，每一個(gè)細(xì)胞中只有一種sgRNA整合進(jìn)基因組并發(fā)揮功能，如果有2萬個(gè)細(xì)胞磺芭，那么可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)2萬個(gè)基因的敲除赁炎，結(jié)合藥物篩選后者細(xì)胞表型選擇，可以獲得表型優(yōu)勢的細(xì)胞钾腺，然后將整合的sgRNA擴(kuò)增并進(jìn)行高通量測序徙垫，通過分析sgRNA序列即可判斷對(duì)應(yīng)的敲除基因；再結(jié)合表型優(yōu)勢細(xì)胞中sgRNA的富集程度放棒，即可以篩選到促進(jìn)和抑制相應(yīng)表型的基因姻报。換而言之，敲除后促進(jìn)表型的基因间螟，其sgRNA在細(xì)胞中將得到富集吴旋；反之损肛，敲除后抑制細(xì)胞表型的基因，其sgRNA在細(xì)胞中將被“丟失”荣瑟。
??以上是常規(guī)CRISPR Screening的方法荧关，而為了避免“搭車效應(yīng)”，即避免一個(gè)細(xì)胞中因同時(shí)出現(xiàn)多種基因敲除而互相干擾對(duì)其功能的現(xiàn)象褂傀，通常在進(jìn)行sgRNA慢病毒感染時(shí)忍啤，會(huì)使用低感染復(fù)數(shù)（MOI）的病毒進(jìn)行細(xì)胞感染，以保證每個(gè)細(xì)胞中最多進(jìn)入一個(gè)sgRNA慢病毒仙辟。但是這種策略同時(shí)也存在一定的問題：需要大量的細(xì)胞和多次生物學(xué)重復(fù)以獲得可靠的結(jié)果同波。這對(duì)于一些細(xì)胞來源受限的研究是一個(gè)比較大的障礙。今天分析的這項(xiàng)研究則可以使用高M(jìn)OI叠国，少細(xì)胞未檩，少生物學(xué)重復(fù)進(jìn)行研究，其策略是針對(duì)相同的sgRNA引入不同的分子條碼（Internal Barcode粟焊，iBar）冤狡。例如，一條sgRNA项棠，表示4種不同的iBar悲雳，那么一次實(shí)驗(yàn)就相當(dāng)于進(jìn)行四次生物學(xué)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
Reference
Zhu, S. et al. Guide RNAs with embedded barcodes boost CRISPR-pooled screens. Genome Biol 20, 20 (2019).
