今天和大家分享的是2020年1月發(fā)表在Journal of Cancer（IF：3.182)上的一篇文章台谊，“Tumour-Infiltrating Immune Cell-Based Subtyping and Signature Gene Analysis in Breast Cancer Based on Gene Expression Profiles”签舞，文章中作者使用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)和CIBERSORT網(wǎng)頁(yè)工具民珍，整合乳腺癌樣本中腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的豐度數(shù)據(jù)盈简，通過(guò)LASSO-Cox回歸分析和聚類(lèi)分析建立了預(yù)后模型和免疫分型舶担，并篩選出預(yù)后相關(guān)的免疫特征基因萄焦。
Tumour-Infiltrating Immune Cell-Based Subtyping and Signature Gene Analysis in Breast Cancer Based on Gene Expression Profiles
基于基因表達(dá)譜對(duì)乳腺癌中腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞進(jìn)行亞型分類(lèi)和特征基因分析
一驾诈、研究背景
乳腺癌發(fā)病率在女性癌癥患者中位居首位毒姨，是一個(gè)具有不同臨床和預(yù)后特征的復(fù)雜疾病集合哑蔫，近年以ER、PR弧呐、HER2將乳腺癌分為管腔A闸迷，管腔B，HER2過(guò)表達(dá)和三陰性四種分子亞型泉懦，但在每個(gè)亞型中仍可以發(fā)現(xiàn)顯著的異質(zhì)性稿黍，特別是管腔B和三陰性乳腺癌。腫瘤免疫研究顯示腫瘤相關(guān)的免疫激活可以改善臨床結(jié)果崩哩，腫瘤浸潤(rùn)免疫淋巴細(xì)胞（TILs）在HER2陽(yáng)性和三陰性乳腺癌（TNBC）中可以作為關(guān)鍵的預(yù)后指標(biāo)巡球。探索新的免疫亞型對(duì)乳腺癌預(yù)后具有重要意義。
二邓嘹、分析流程
三酣栈、結(jié)果解讀
1. 數(shù)據(jù)準(zhǔn)備和臨床信息概述
經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)合并和過(guò)濾，納入來(lái)自12個(gè)GEO數(shù)據(jù)集汹押、具有預(yù)后信息的801例乳腺癌樣本和964例正常組織樣本矿筝，平均隨訪5.54年，以及TCGA-BRCA的956個(gè)樣本棚贾、METABRIC的372個(gè)樣本窖维。對(duì)樣本通過(guò)網(wǎng)頁(yè)工具CIBERSORT估計(jì)每個(gè)免疫細(xì)胞亞群的絕對(duì)免疫分?jǐn)?shù)和豐度，gene signatures使用的是LM22和LM7妙痹，剔除其中CIBERSORT P value >= 0.05的樣本進(jìn)行下一步分析铸史。
表1：GEO、BRCA和METABRIC數(shù)據(jù)的乳腺癌患者臨床病理特征怯伊，展示了年齡琳轿、TNM分級(jí)、分子亞型等信息耿芹。
圖1：使用CIBERSORT計(jì)算的免疫細(xì)胞豐度崭篡，展示了兩種signatures文件計(jì)算得到的豐度（A和B）和三個(gè)數(shù)據(jù)集中豐度結(jié)果的P值（C和D）。
表1：乳腺癌患者臨床病理特征
圖1：CIBERSORT計(jì)算的免疫細(xì)胞豐度
2. 腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的豐度和分布分析
在不同臨床病理特征分組中比較腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞亞群的估計(jì)豐度和分布吧秕。顯示免疫細(xì)胞在HER2過(guò)表達(dá)和三陰性亞型中更豐富琉闪，且總體豐度與不良病理特征有關(guān)，HR陰性(P < 0.001)砸彬、淋巴結(jié)陽(yáng)性 (P= 0.01) 塘偎、較高的組織學(xué)分級(jí)(P < 0.001)疗涉。
進(jìn)一步研究顯示淋巴結(jié)陽(yáng)性的腫瘤中CD8 + T細(xì)胞和漿細(xì)胞百分比較高，而淋巴結(jié)陰性腫瘤中活化的肥大細(xì)胞吟秩，Treg細(xì)胞咱扣，靜息NK和DC百分比較高。隨著組織學(xué)等級(jí)的提高涵防，巨噬細(xì)胞闹伪，幼稚B細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞的百分比增加，而γδT細(xì)胞壮池，Treg細(xì)胞和肥大細(xì)胞減少偏瓤。
單因素Cox分析篩選預(yù)后相關(guān)的免疫細(xì)胞子集。結(jié)果顯示在管腔B椰憋，HER2過(guò)表達(dá)和三陰性乳腺癌中免疫細(xì)胞的豐度與生存率顯著相關(guān)厅克。以風(fēng)險(xiǎn)比HR進(jìn)行subgroup analysis，顯示所有浸潤(rùn)細(xì)胞可分為保護(hù)相關(guān)survival-favourable橙依、危險(xiǎn)相關(guān)survival-unfavourable以及中性neutral 3個(gè)子集（表2）证舟。
表2：腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞亞群的COX分析結(jié)果
3. 建立基于腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的乳腺癌預(yù)后模型
基于單因素分析結(jié)果，作者使用GEO數(shù)據(jù)通過(guò)LASSO-Cox回歸進(jìn)一步篩選免疫細(xì)胞亞群并在管腔B窗骑，HER2過(guò)表達(dá)和三陰性亞型中建立模型女责，從22個(gè)亞群中篩選出7個(gè)，根據(jù)免疫細(xì)胞豐度計(jì)算免疫風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分immunorisk score（IRS）作為預(yù)后指標(biāo)创译。IRS計(jì)算公式：
Immunorisk score = 2^((-0.056)* B cell+(-0.017)* CD8+T cell+0.151* γδT+(-0.060)* NK cell+(-0.165)* activated CD4+ memory T cell+(0.099)* activated mast cell+(0.177)*neutrophils)
構(gòu)建可預(yù)測(cè)3年和5年OS的列線(xiàn)圖（圖A）抵知，C指數(shù)0.71（95％CI：0.64-0.78），并展示了列線(xiàn)圖的校準(zhǔn)曲線(xiàn)（圖B和C）软族，顯示五年OS的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度較高刷喜。
圖2：基于腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的列線(xiàn)圖預(yù)后模型
圖3：列線(xiàn)圖模型的校準(zhǔn)曲線(xiàn)
在GEO樣本中以年齡、腫瘤體積立砸、淋巴結(jié)三種特征進(jìn)行分組掖疮，分析IRS高低組的生存差異。結(jié)果顯示IRS在高風(fēng)險(xiǎn)組中更為準(zhǔn)確：年齡大于50歲仰禽，腫瘤大于2 cm或淋巴結(jié)陽(yáng)性的患者（圖4）
圖4：不同臨床病理特征分組的IRS生存曲線(xiàn)
使用TCGA-BRCA和METABRIC數(shù)據(jù)驗(yàn)證Cox回歸模型氮墨，結(jié)果顯示較高的IRS在兩者中均預(yù)后不良纺蛆，TCGA-BRCA（HR 11.80吐葵，95％CI：3.86-36.13，P <0.001）和METABRIC（HR 1.24桥氏，95％CI：1.02-1.51温峭， P = 0.035）。
展示兩數(shù)據(jù)集中7種免疫細(xì)胞亞群的免疫評(píng)分熱圖（圖A）以及IRS四分位數(shù)分組的生存曲線(xiàn)（圖B）字支》锊兀可以看到IRS較高的樣本中Survival favourable細(xì)胞亞群免疫評(píng)分低奸忽，而Survival unfavourable亞群評(píng)分高。并且四分位數(shù)劃分的Q1-Q4 IRS的OS具有顯著性差異揖庄。以上驗(yàn)證結(jié)果表明IRS可以作為乳腺癌預(yù)后指標(biāo)栗菜。
圖5：IRS在TCGA-BRCA和METABRIC數(shù)據(jù)中的浸潤(rùn)細(xì)胞免疫評(píng)分及OS驗(yàn)證
4. 乳腺癌免疫分型的聚類(lèi)分析
在3種乳腺癌亞型中使用GEO隊(duì)列進(jìn)行無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)分析。結(jié)果聚為兩類(lèi)：免疫亞型A（immune-reactive）中survival-favourable的免疫細(xì)胞豐度更高蹄梢；免疫亞型B (immune-nonreactive)中survival-unfavourable豐度高：Immunotype A （B_cellhigh NKhigh CD8+_ Thigh CD4+ _ memory_T_activatedhigh γδTlow Mast_cell_activatedlow Neutrophillow）疙筹；immunotype B （B_celllow NKlow ?CD8+_ Tlow CD4+_memory_T_activatedlow γδThigh Mast_cell_activatedhigh Neutrophilhigh)
圖6A展示了聚類(lèi)分析熱圖結(jié)果和生存曲線(xiàn)，顯示在GEO數(shù)據(jù)中A禁炒、B兩型OS具有顯著差異而咆。
在TCGA-BRCA和METABRIC數(shù)據(jù)中進(jìn)行了驗(yàn)證。免疫A型METABRIC數(shù)據(jù)中OS與B型具有顯著差異（圖6C）幕袱。
在三種乳腺癌分子亞型中進(jìn)行多因素Cox分析暴备，結(jié)果顯示Immunotype預(yù)后價(jià)值顯著。（表3）
圖6：基于免疫細(xì)胞亞群的無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)及生存分析
表3：三種乳腺癌分子亞型中的多因素COX分析
作者進(jìn)一步比較了兩種免疫亞型的IRS们豌、免疫細(xì)胞亞群豐度和生存差異涯捻。并且分析了重要免疫細(xì)胞因子和檢查點(diǎn)分子的表達(dá)差異。
免疫A型IRS顯著低于免疫B型玛痊，且survival-favourable細(xì)胞亞群免疫評(píng)分較高（圖7A-B）汰瘫。
與免疫B型相比，免疫A型具有更好的5年OS（85.7％ vs 73.4％擂煞，P <0.001)混弥，RFS，DFS和DMFS也顯著更好对省。（圖7C-F）
圖8比較幾種重要細(xì)胞因子IL-2蝗拿、IFN-γ、TGF-β和免疫檢查點(diǎn)分子PD-L1蒿涎、PD-1哀托、CTLA-4在兩種免疫亞型中的表達(dá)。結(jié)果顯示GEO和TCGA-BRCA數(shù)據(jù)中免疫A型的IL-2和IFN-γ劳秋，PD-L1仓手，PD-1和CTLA-4表達(dá)顯著高于B型。而TGF-β在B型中水平更高玻淑。
圖7：免疫A型嗽冒、免疫B型的IRS差異分析和生存分析
圖8：兩種免疫亞型中重要免疫細(xì)胞因子和檢查點(diǎn)分子的表達(dá)
5. 免疫A型和免疫B型之間的免疫特征基因分析
作者對(duì)兩種免疫亞型進(jìn)行差異表達(dá)基因分析，鑒定出202個(gè)高表達(dá)的免疫相關(guān)基因补履。KEGG分析顯示這些基因與T細(xì)胞分化添坊，NK細(xì)胞毒性，細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用箫锤，NF-κB信號(hào)通路等通路相關(guān) 贬蛙。PPI分析表明該網(wǎng)絡(luò)由T細(xì)胞雨女，B細(xì)胞和NK細(xì)胞相關(guān)基因和細(xì)胞因子組成。作者進(jìn)一步對(duì)每個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行單因素和多因素Cox回歸分析阳准，鑒定出與OS顯著相關(guān)的前列腺素D2合酶PTGDS氛堕。進(jìn)一步分析乳腺癌中PTGDS的功能：
生物信息學(xué)結(jié)果：
圖9：在METABRIC數(shù)據(jù)中分析正常組和不同臨床病理特征組中PTGDS及其受體PTGDR的表達(dá)差異，結(jié)果顯示在腫瘤體積大（圖B,F）野蝇、高臨床分期（圖C,G）和高組織學(xué)分級(jí)（圖D）的腫瘤中绿满，PTGDS和PTGDR的mRNA水平顯著下調(diào)坷牛，表明PTGDS可以作為保護(hù)因子。
作者還以平均PTGDS mRNA水平將樣本分為高低表達(dá)組進(jìn)行了差異基因分析，顯示高低組間的差異基因與乳腺癌中的免疫相關(guān)通路有關(guān)丸边。
最后對(duì)GEO樣本中PTGDS表達(dá)水平與免疫細(xì)胞亞群豐度進(jìn)行了相關(guān)性分析吕漂，顯示PTGDS表達(dá)與保護(hù)性TILs的豐度正相關(guān)背镇，而與危險(xiǎn)性的M0/M2巨噬細(xì)胞殿较、粒細(xì)胞豐度負(fù)相關(guān)。
圖9：METABRIC數(shù)據(jù)中不同臨床病理特征組PTGDS/PTGDR的表達(dá)差異
組織學(xué)結(jié)果：
在98例乳腺癌患者石蠟切片中進(jìn)行了免疫組化（IHC）和免疫熒光（IF）檢測(cè)澜躺。圖10A顯示TNBC組織中基質(zhì)TILs的PTGDS表達(dá)明顯高于導(dǎo)管上皮細(xì)胞蝉稳，與生信分析結(jié)果一致，圖10B顯示PTGDS在乳腺癌組織中表達(dá)不均勻掘鄙。
PTGDS 和免疫細(xì)胞標(biāo)志物的IHC和IF染色確定表達(dá)PTGDS的特定細(xì)胞類(lèi)型耘戚。結(jié)果顯示，IHC染色中PTDGS與多種TILs標(biāo)志物共表達(dá)（圖10C）操漠，IF染色顯示CD19 + / CD20 + B細(xì)胞和CD4 + / CD8 + T細(xì)胞均與PTGDS共定位（圖11）收津。
圖10：IHC檢測(cè)乳腺癌及癌旁組織中PTDGS的表達(dá)以及與不同免疫細(xì)胞亞群標(biāo)志物的共表達(dá)
圖11：IF檢測(cè)TNBC乳腺癌組織中PTGDS與CD19+ B cells 和CD4+/CD8+ T cells 共定位
最后，作者根據(jù)IHC鑒定的平均PTGDS表達(dá)水平將98位患者分為高表達(dá)和低表達(dá)組分析臨床病理特征的差異浊伙。結(jié)果表明PTGDS的高表達(dá)與TIL高浸潤(rùn)水平撞秋、腫瘤較小以及較早的病理分期有關(guān)，與生信分析的結(jié)果一致嚣鄙。
表4：PTGDS高表達(dá)組和低表達(dá)組臨床病理特征的差異
小結(jié)
????????作者首先使用CIBERSORT對(duì)樣本進(jìn)行腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞亞群的豐度評(píng)估吻贿，然后進(jìn)行單因素和多因素Cox分析篩選其中具有顯著預(yù)后意義的子集，在管腔B哑子，HER2過(guò)表達(dá)和三陰性乳腺癌建立了以IRS作為浸潤(rùn)免疫細(xì)胞指標(biāo)的預(yù)后模型舅列，并且對(duì)IRS的預(yù)后意義進(jìn)行評(píng)估。接著對(duì)GEO樣本進(jìn)行聚類(lèi)卧蜓，得到免疫A型帐要、免疫B型兩類(lèi)，在TCGA烦却、METABRIC數(shù)據(jù)中進(jìn)行了驗(yàn)證宠叼，同樣分析了免疫分型的臨床病理特征差異及預(yù)后價(jià)值先巴。最后作者篩選了免疫A型和免疫B型之間的差異表達(dá)基因其爵，鑒定出特征基因PTGDS冒冬，進(jìn)一步分析不同臨床病理特征分組的PTGDS表達(dá)差異，并通過(guò)IHC和IF驗(yàn)證其在TILs中的特征表達(dá)摩渺。
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