轉(zhuǎn)錄組學(xué)習(xí)一（軟件安裝）
轉(zhuǎn)錄組學(xué)習(xí)二（數(shù)據(jù)下載）
轉(zhuǎn)錄組學(xué)習(xí)三（數(shù)據(jù)質(zhì)控）
轉(zhuǎn)錄組學(xué)習(xí)四（參考基因組及gtf注釋探究）
轉(zhuǎn)錄組學(xué)習(xí)五（reads的比對(duì)與samtools排序）
轉(zhuǎn)錄組學(xué)習(xí)六（reads計(jì)數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)化）
轉(zhuǎn)錄組學(xué)習(xí)七（差異基因分析）
轉(zhuǎn)錄組學(xué)習(xí)八（功能富集分析）
任務(wù)
- 各種比對(duì)軟件的簡(jiǎn)單探究
- 比對(duì)軟件hisat2 明白其基本用法
- 將fastq文件的reads比對(duì)到index參考基因組上得到SAM文件
- 用samtools將SAM文件轉(zhuǎn)為BAM文件，并且排序索引好
- 對(duì)BAM文件進(jìn)行簡(jiǎn)單的QC冀泻。
前言
對(duì)于有參轉(zhuǎn)錄組的分析可基本分為：<font color = darkblue>fastq原始測(cè)序文件的質(zhì)控常侣、參考基因組的獲取、fastq文件的reads比對(duì)到參考基因組上(mapping)弹渔、比對(duì)的reads的計(jì)數(shù)胳施、表達(dá)定量、差異基因的分析肢专；融合基因的檢測(cè)舞肆、可變剪接新轉(zhuǎn)錄本，RNA編輯和突變的檢測(cè)</font>博杖。前面的四節(jié)只能算是一些基本數(shù)據(jù)的探究和準(zhǔn)備椿胯，從這一節(jié)reads的比對(duì)開(kāi)始才算是真正進(jìn)入轉(zhuǎn)錄組分析的核心部分。（奈何特么最近忙到爆剃根，整天被push[攤手][攤手][攤手][攤手][攤手]估計(jì)進(jìn)展會(huì)放慢了哩盲。11/5）
<font color=orange>各種比對(duì)軟件的簡(jiǎn)單探究</font>
參考文獻(xiàn):2017年發(fā)表在NATURE COMMUNICATION上的一篇Gaining comprehensive biological insight into the transcriptome by performing a broad-spectrum RNA-seq analysis文章對(duì)現(xiàn)在RNA-seq所涉及的所有軟件都進(jìn)行了評(píng)估，探究了各種軟件的好壞跟继，另外在幾篇公眾號(hào)文章里皆對(duì)此篇文章有較為詳細(xì)的解讀轉(zhuǎn)錄組分析工具哪家強(qiáng)种冬？。
-
<font color= darkblue>拿到了RNA-seq的data后可以做的數(shù)據(jù)處理流程：</font>
image -
<font color= darkblue>簡(jiǎn)單看一下里面所設(shè)計(jì)到的各個(gè)軟件名字舔糖，很多都沒(méi)見(jiàn)過(guò)娱两，不過(guò)就當(dāng)留個(gè)印象吧</font>
-
RNA edits：
GIREMI, multiple-samples, pooled-samples -
SNP/Indel：
GATK3, SAMtools -
RNA fusions:
JAFFA, FusionCatcher, SOAPfuse, STAR-Fusion, TopHat-fusion -
==Short reads== mapping:
Tophat, STAR, HISAT2 -
Transcript assembly:
cufflinks, StringTie#有參的比對(duì)完組裝 -
De novo assembly:
Oases, trinity, SOAPdenovo-Trans#無(wú)參 從頭組裝 -
==Long reads== correction:
ccs, error-free, SLR RNA-seq -
Mapping and alignment:
LSC, LoRDEC, GMAP, STARlong - ==表達(dá)定量相關(guān)==Alignment-free isoform quantification:
Sailfish, kallisto, Salmon-SMEM, Salmon-Quasi -
Abundance estimation to expression:
Cufflinks, IDP, StringTie, eXpress, Salmon-Aln, featureCounts -
Differential analysis to Differential expression:
Sleuth, Cuffdiff, edgeR, DESeq2, Ballgown, limma
-
RNA edits：
-
<font color= darkblue>最后推薦對(duì)于RNA-seq數(shù)據(jù)處理每一步最佳的軟件推薦流程：</font>
image -
結(jié)果可知:對(duì)于此次有參考基因組的轉(zhuǎn)錄組短reads比對(duì)部分 ，最佳使用的軟件就是HISAT2金吗，STAR軟件十兢。
- 基于參考基因組的轉(zhuǎn)錄組組裝：二代數(shù)據(jù)用StringTie, Cufflinks趣竣；三代數(shù)據(jù)用Pac-bio的軟件Iso-Seq。二代和三代雜交拼接旱物，用IDP（Isoform Detection and Prediction）遥缕。比對(duì)軟件GMAP，STAR-long
- 轉(zhuǎn)錄組拼裝質(zhì)量評(píng)估依據(jù)GENCODE v19的參考轉(zhuǎn)錄組注釋宵呛，不存在于這個(gè)集合的轉(zhuǎn)錄本視為假陽(yáng)性单匣。
剩下來(lái)關(guān)于轉(zhuǎn)錄組拼接和表達(dá)定量，差異分析內(nèi)容等后期測(cè)試數(shù)據(jù)的時(shí)候再好好學(xué)習(xí)一下宝穗。
<font color=orange>HISAT2 及其基本使用方法</font>
ps：Hisat2軟件算是我最開(kāi)始接觸生物信息分析户秤，接觸轉(zhuǎn)錄組分析所了解到的第一個(gè)軟件了吧。記得是今年5月份在雁棲湖去蹭的一門(mén)生物信息實(shí)踐課上老師給推薦了這篇HISAT2的文章Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown.逮矛。當(dāng)時(shí)記得跟著這篇Pipeline鸡号，是一行命令一行命令的輸，花了幾天時(shí)間終于把這個(gè)流程走了一遍须鼎。雖然當(dāng)時(shí)很多東西都不懂鲸伴，但也算是開(kāi)啟了我的學(xué)生物信息，數(shù)據(jù)處理晋控，計(jì)算機(jī)知識(shí)的開(kāi)篇啟蒙式文章吧汞窗。
首先，官方網(wǎng)站及其ManualHISAT2:
graph-based alignment of next generation sequencing reads to a population of genomes建立參考基因組的索引index文件：
短的reads是需要比對(duì)到參考基因組上然后確定定位到特定基因組序列上的reads的數(shù)量才能進(jìn)一步確定表達(dá)量赡译。比對(duì)到參考基因組上就是先將參考基因組的genome用算法轉(zhuǎn)換成index杉辙，眾多比對(duì)軟件所使用的比對(duì)算法不同。
# 建立參考基因組hg19和hg38的index索引捶朵，這一步是十分花時(shí)間的，加了個(gè)-p 多線程還花了好幾個(gè)小時(shí)狂男。
# 提取gtf文件可變剪接的位置
hisat2_extract_splice_sites.py Homo_sapiens.GRCh38.87.chr.gtf > hg38.ss
# 提取gtf文件外顯子的位置
hisat2_extract_exons.py Homo_sapiens.GRCh38.87.chr.gtf >hg38.exon
#建立索引
hisat2-build --ss hg38.ss --exon hg38.exon [輸入基因組文件]Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa [輸出地址及名稱]hg38
- 軟件基本用法及參數(shù)選擇
基本默認(rèn)hisat2用法：
<font color=red>hisat2 [options]* -x <ht2-idx> {-1 <m1> -2 <m2> | -U <r> | --sra-acc <SRA accession number>} [-S <sam>]</font>
- **[option]** :可選參數(shù)综看，各種參數(shù)才是進(jìn)階里的名堂。比如
input: --phred33, --phread64,--sra-acc
alignment: --ignore-quals,
Spliced Alignment: 可變剪接相關(guān)
Scoreing, Reporting -p 多線程
- -x:參考基因組的位置ucsc_hg38/hg38岖食；
- -1,-2雙末端測(cè)序红碑，or -U 單端測(cè)序
- -S：輸出文件，文件夾/ .sam 文件
# 處理多個(gè)文件：對(duì)于56~58為人類的數(shù)據(jù)泡垃，3個(gè)循環(huán)即可
for i in `seq 56 58`
do
nohup hisat2 -x /sas/supercloud-kong/wangtianpeng/Database/human/hg19/genome -1 ~/1_raw_data/SRR35899${i}_1.fastq.gz -2 ~/1_raw_data/SRR35899${i}_2.fastq.gz -S ~/4_mapping/SRR35899${i}.sam &
done
-
比對(duì)結(jié)果：
image- 根據(jù)結(jié)果可知： 3個(gè)樣本平均是96%左右比例的reads是比對(duì)上的析珊，其中28.6M的reads里，1.8M未比對(duì)上蔑穴，24.6M的reads確切的一次比對(duì)上忠寻，2.2M比對(duì)超過(guò)1次。
- 其中對(duì)于未必對(duì)上的1.8M里存和，不按順序來(lái)奕剃，3.24%比對(duì)上一次衷旅，剩下來(lái)的用單端數(shù)據(jù)比對(duì)，32.11%比對(duì)上一次纵朋。
對(duì)于結(jié)果還需要進(jìn)一步的解讀柿顶，比如1. 比對(duì)上多次該如何解釋呢？這個(gè)對(duì)結(jié)果有什么影響嗎操软？2. 未比對(duì)上的6.41%里面又是如何處理的呢嘁锯，該如何解讀，對(duì)比對(duì)結(jié)果有什么影響嗎聂薪？
<font color=orange>用samtools將SAM文件轉(zhuǎn)為BAM文件家乘，并且排序索引好</font>
- <font color=darkblue>Samtools軟件參數(shù)說(shuō)明</font>：
-
-view：將Sam文件轉(zhuǎn)換為bam文件烤低，然后才能對(duì)bam文件進(jìn)行各種操作，比如數(shù)據(jù)的排序和提取笆载，最后將排序或提取的數(shù)據(jù)輸出為bam或者sam格式扑馁；基本命令轉(zhuǎn)換：
samtools view -Sb SRR56.sam > SRR56.bam；查看bam文件：samtools view SRR56.bam | less -S -
-sort, index:排序凉驻，然后建立索引腻要。
samtools sort eg2.bam eg2.sorted,samtools index .sorted默認(rèn)按照染色體位置進(jìn)行排序，而-n參數(shù)則是根據(jù)read名進(jìn)行排序涝登。當(dāng)然還有一個(gè)-t 根據(jù)TAG進(jìn)行排序 - faidx: ==對(duì)fasta文件建立索引,生成的索引文件以.fai后綴結(jié)尾雄家。可以快速提取部分序列==
- merge/cat:整合聚合多個(gè)排序的bam文件
- tview：tview能直觀的顯示出reads比對(duì)基因組的情況胀滚。
- flagstat: 統(tǒng)計(jì)比對(duì)結(jié)果
- depth: 得到每個(gè)堿基位點(diǎn)的測(cè)序深度
-
-view：將Sam文件轉(zhuǎn)換為bam文件烤低，然后才能對(duì)bam文件進(jìn)行各種操作，比如數(shù)據(jù)的排序和提取笆载，最后將排序或提取的數(shù)據(jù)輸出為bam或者sam格式扑馁；基本命令轉(zhuǎn)換：
Usage: samtools faidx [ [...]]
對(duì)基因組文件建立索引
$ samtools faidx genome.fasta
#生成了索引文件genome.fasta.fai,是一個(gè)文本文件趟济，分成了5列。第一列是子序列的名稱咽笼；第二列是子序列的長(zhǎng)度顷编；個(gè)人認(rèn)為“第三列是序列所在的位置”，因?yàn)樵摂?shù)字從上往下逐漸變大剑刑，最后的數(shù)字是genome.fasta文件的大邢蔽场；第4和5列不知是啥意思施掏。于是通過(guò)此文件钮惠，可以定位子序列在fasta文件在磁盤(pán)上的存放位置，直接快速調(diào)出子序列七芭。
#由于有索引文件素挽，可以使用以下命令很快從基因組中提取到fasta格式的子序列
$ samtools faidx genome.fasta scffold_10 > scaffold_10.fasta
-
<font color=darkblue>SAM文件說(shuō)明</font>
- SAM是一種序列比對(duì)格式標(biāo)準(zhǔn)，由sanger制定抖苦，是以TAB為分割符的文本格式毁菱。主要應(yīng)用于測(cè)序序列mapping到基因組上的結(jié)果表示米死，當(dāng)然也可以表示任意的多重比對(duì)結(jié)果。
- SAM要處理的問(wèn)題包括：序列（read)贮庞，mapping到多個(gè)參考基因組（reference）上峦筒；
同一條序列，分多段（segment）比對(duì)到參考基因組上窗慎；
無(wú)限量的物喷，結(jié)構(gòu)化信息表示，包括錯(cuò)配遮斥、刪除峦失、插入等比對(duì)信息；
- read 名稱
- SAM 標(biāo)記
- Chromesome
- 5′端起始位置
- MAPQ（mapping quality术吗，描述比對(duì)的質(zhì)量尉辑，數(shù)字越大，特異性越高）
- CIGAR字串较屿，記錄插入隧魄，刪除，錯(cuò)配以及splice junctions（后剪切拼接的接頭）
- mate名稱隘蝎，記錄mate pair信息
- mate位置
- 模板長(zhǎng)度
- reads序列
- reads質(zhì)量
- 程序用的標(biāo)記
- <font color=darkblue>具體轉(zhuǎn)換bam文件购啄、對(duì)bam文件排序、生成索引</font>
for i in `seq 56 58`
do
samtools view -S ../4_mapping/SRR35899${i}.sam -b > ./SRR35899${i}.bam
samtools sort ./SRR35899${i}.bam -o ./SRR35899${i}_sorted.bam
samtools index ./SRR35899${i}_sorted.bam
done
-
生成結(jié)果文件
image
<font color=orange>對(duì)BAM文件進(jìn)行簡(jiǎn)單的QC</font>
比對(duì)結(jié)果的質(zhì)控主要包括：比對(duì)上的reads占總reads的百分比嘱么；Reads比對(duì)到外顯子和參考鏈上的覆蓋度是否一致狮含；比對(duì)到參考基因組，多重比對(duì)reads曼振。
-
根據(jù)他人文章所述几迄，對(duì)BAM文件進(jìn)行QC的軟件包括：
簡(jiǎn)單的用bamtools進(jìn)行質(zhì)控
bamtools -in SRR56.bam
qualimap bamqc -in SRR56.bam
-
結(jié)果：
[圖片上傳失敗...(image-191ea6-1522327436872)]
image
參考文獻(xiàn)
- [轉(zhuǎn)錄組分析工具哪家強(qiáng)？]https://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzI5MTcwNjA4NQ==&mid=2247484106&idx=1&sn=687a0def51f6ea91a335754eb3dc9ca9&chksm=ec0dc740db7a4e564e5b1e93a36e5d9447581e262eec9c2983d1d4e76788d673c9c07dec8f8e&scene=21#wechat_redirect
- [轉(zhuǎn)錄組分析工具大比拼 （完整翻譯版）] https://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzI5MTcwNjA4NQ==&mid=2247484106&idx=2&sn=a09fa127d625c4072ae0343795346c56&chksm=ec0dc740db7a4e56821f32f60700027c85db46e81089721d1bbe23ceefa86160d9661c2f2d4c&scene=21#wechat_redirect
- 從零開(kāi)始學(xué)轉(zhuǎn)錄組（5） 序列比對(duì) [https://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzAxMDkxODM1Ng==&mid=2247484720&idx=1&sn=4bb3e3d2182ffe937d58dc135b4bbd24&scene=21#wechat_redirect]
- 轉(zhuǎn)錄組入門(mén)5-序列比對(duì)[http://fbb84b26.wiz03.com/share/s/3XK4IC0cm4CL22pU-r1HPcQQ22cMcc2su4s32f-t6Q1eEC8t]
