一、3D基因組之ChIP-seq?
????????基因組的三維立體結(jié)構(gòu)的主要組成是DNA和蛋白質(zhì)要糊。研究基因組的三維立體結(jié)構(gòu)就是研究DNA與蛋白之間的互作竹祷。ChIP一直是研究蛋白與DNA互作的重要方法凉倚。他可以顯示眾多調(diào)節(jié)蛋白在基因組上的分布。下表是生物體內(nèi)常見的幾種DNA調(diào)節(jié)蛋白嫂沉。
????????Histone是核小體的基本組成蛋白稽寒，核小體是染色質(zhì)的基本組成單位。組蛋白的修飾（如：甲基化趟章，乙跣硬冢化，磷酸化等）使核小體在DNA上發(fā)生移動蚓土，改變核小體的位置宏侍。這使得特定的組蛋白修飾代表特定的生物學(xué)特征。例如H3K27ac代表激活型啟動子區(qū)域蜀漆，H3K27me3代表抑制型啟動子區(qū)域谅河，等等。
? ? ? ? 除了組蛋白外，還有一類重要的調(diào)控元件-轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)節(jié)染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能绷耍，然而吐限，轉(zhuǎn)錄因子要與RNA聚合酶II互作，才可以調(diào)控基因表達(dá)锨天。
? ? ? ? CTCF是一類重要的絕緣子蛋白毯盈，與RAD21蛋白形成穩(wěn)定的3維立體結(jié)構(gòu)區(qū)域，維持染色質(zhì)的正常形態(tài)病袄。
????????另外搂赋，您需要根據(jù)目的基因的表達(dá)情況選擇相應(yīng)的ChIP組合方式。
1.ChIP-seq數(shù)據(jù)分析
ChIP-seq的數(shù)據(jù)呈現(xiàn)形式是多種多樣的益缠。但主要以3種形式出現(xiàn)在文章中脑奠。
①最常見的peak圖
②研究轉(zhuǎn)錄起始位點的TSS距離分布圖，可以清楚的觀察到TSS位點處幅慌，多種蛋白的分布情況宋欺。
③比較直觀的熱圖，可以清楚的看出同一DNA區(qū)域胰伍，不同蛋白的分布情況齿诞，以及同一蛋白在不同DNA區(qū)域的分布情況。
二骂租、3D基因組之Hi-C技術(shù)?
????????Hi-C（High-throughput/resolutionchromosome conformation capture）技術(shù)祷杈，以整個細(xì)胞核為研究對象，利用高通量測序技術(shù)渗饮，結(jié)合生物信息學(xué)方法但汞，研究全基因組范圍內(nèi)整個染色質(zhì)DNA在空間位置上的關(guān)系；通過對染色質(zhì)內(nèi)全部DNA相互作用模式進(jìn)行捕獲互站，獲得高分辨率的染色質(zhì)三維結(jié)構(gòu)信息私蕾。
1.Hi-C技術(shù)流程
Hi-C,Hi-C的基本流程是首先將染色質(zhì)，用交聯(lián)HindIII限制性核酸內(nèi)切酶將DNA片段切開胡桃，形成粘性末端踩叭，將帶有dCTP-biotion補(bǔ)齊粘性末端，用T4連接酶連接翠胰，純化鏈接產(chǎn)物容贝，用鏈霉親和磁珠捕獲帶有biotion的DNA互作片段，測序比對DNA互作區(qū)域亡容。
如何看懂Hi-C結(jié)果?
如圖所示嗤疯，Hi-C主要有兩種表現(xiàn)形式，一種是原始的方形圖闺兢，一種是比較直觀的三角圖茂缚，其實戏罢，這兩種圖實際上是同一張圖，先看方形圖脚囊，橫縱坐標(biāo)都代表同一條染色體龟糕，對角線上的點像橫縱坐標(biāo)的投影，因此悔耘，對角線也表示染色體讲岁。內(nèi)部馬賽克點分別向橫縱坐標(biāo)及對角線延伸，延伸得到的焦點衬以，為互作基因在染色體上的位置缓艳。馬賽克點的顏色越深，代表基因互作強(qiáng)度越大看峻。
Hi-C得出的數(shù)據(jù)是非常強(qiáng)大的阶淘。Hi-C的最小分辨率為5kb，在這個分辨率下互妓，我們可以清楚的觀察到基因的成環(huán)結(jié)構(gòu)溪窒。這其中包括基因環(huán)，轉(zhuǎn)錄環(huán)冯勉，結(jié)構(gòu)環(huán)以及增強(qiáng)子-啟動子環(huán)澈蚌。
當(dāng)Hi-C分辨率到達(dá)10kb時，我們會發(fā)現(xiàn)多個相關(guān)連loop組成的拓?fù)湎嚓P(guān)結(jié)構(gòu)域（TADs）灼狰。且TADs邊界上一般都會有CTCF的富集宛瞄。
當(dāng)分辨率到達(dá)50kb時，我們可以看到由相關(guān)TADs組成的染色質(zhì)區(qū)域伏嗜。
當(dāng)我們繼續(xù)增大分辨率坛悉，我們將看到全部染色體的互作情況伐厌。
Hi-C數(shù)據(jù)強(qiáng)大我們已經(jīng)看到承绸，但想精確地模擬3D基因組的結(jié)構(gòu)，還需要與ChIP-seq挣轨、RNA-seq军熏、DNase-seq、FAIRE-seq等聯(lián)合分析卷扮，才能精確構(gòu)建3D模型荡澎。
三、3D模型驗證技術(shù)?
基因組模型構(gòu)建完成后晤锹，我們需要對模型進(jìn)行驗證摩幔。主要從兩個方面對模型進(jìn)行驗證，一個是模型結(jié)構(gòu)進(jìn)行驗證鞭铆，一個是對模型功能進(jìn)行驗證或衡。對模型結(jié)構(gòu)驗證，我們也是從兩個方面進(jìn)行驗證，一個利用DNA FISH對模型的空間定位進(jìn)行研究封断，一個是利用3C對模型的空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行驗證斯辰。對模型的功能驗證，我們主要利用CRISPR技術(shù)去除模型結(jié)構(gòu)坡疼，觀察對應(yīng)基因及細(xì)胞代謝的變化彬呻。
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1.DNA FISH-模型空間定位驗證
DNA FISH的基本流程與RNA及蛋白FISH相似，但DNA FISH探針要求更加嚴(yán)格柄瑰，且細(xì)胞內(nèi)的DNA及探針均需要變性闸氮。DNA FISH是觀察細(xì)胞核中DNA分步，這需要更高放大倍數(shù)的共聚焦顯微鏡教沾。
如下圖所示湖苞，在母本染色體中，三個基因是分開的详囤，在父本染色體中财骨，3個基因經(jīng)過環(huán)形折疊在一起。
2.? ??3C-模型空間結(jié)構(gòu)驗證
3C的基本流程如下圖所示藏姐。染色質(zhì)先進(jìn)行交聯(lián)隆箩，交聯(lián)后酶切，連接羔杨，再進(jìn)行QPCR檢測捌臊。3C技術(shù)主要捕獲的是兩基因間的互作，因此這種技術(shù)常用來驗證基因間的互作兜材。
下圖所描述的是基因promoter區(qū)與增強(qiáng)子區(qū)的互作驗證理澎，我們可以看到FIP1L1與914kb處的增強(qiáng)子有互作。
3.CRISPR-模型功能驗證
我們利用CRISPR?技術(shù)敲掉CTCF motif曙寡，使CTCF無法結(jié)合糠爬，基因組的3D結(jié)構(gòu)模型被破壞，相應(yīng)基因的表達(dá)受到影響举庶，細(xì)胞功能也可能會受到影響执隧。CRISPR的功能是強(qiáng)大的，您可以根據(jù)您的需要敲除增強(qiáng)子户侥，沉默子镀琉，絕緣子，甚至基因蕊唐。
