The bone marrow microenvironment at single-cell resolution
（單細(xì)胞通量下的骨髓微環(huán)境）
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摘要
在本研究中鬓梅，在體內(nèi)平衡和應(yīng)激誘導(dǎo)的造血條件下分別構(gòu)建了小鼠骨髓血管，血管周圍和成骨細(xì)胞群的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜。該研究揭示了骨髓龕中先前未被認(rèn)可的細(xì)胞異質(zhì)性水平和闡明了造血生長(zhǎng)因子键袱，趨化因子和膜結(jié)合配體的細(xì)胞來源。我們的研究表明，在壓力條件下，包括血管周圍細(xì)胞的脂肪細(xì)胞傾斜在內(nèi)的骨髓龕的轉(zhuǎn)錄重塑相當(dāng)大睦裳。應(yīng)激條件下，觀察到由DIl1和DIl4編碼的血管Notch delta樣配體基因表達(dá)下調(diào)撼唾。在無血管DII4基因存在的情況下廉邑，造血干細(xì)胞會(huì)過早地誘導(dǎo)髓樣特征的轉(zhuǎn)錄進(jìn)程。以上這些發(fā)現(xiàn)重塑了人們對(duì)骨髓龕細(xì)胞結(jié)構(gòu)的認(rèn)知倒谷，揭示對(duì)壓力極其敏感的動(dòng)力學(xué)和異質(zhì)性分子圖譜蛛蒙，同時(shí)表明單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)在評(píng)估離散龕細(xì)胞群體在造血功能的調(diào)節(jié)中的效用。
? ? ? 造血-產(chǎn)生成熟血細(xì)胞的過程-對(duì)于發(fā)揮各種功能至關(guān)重要渤愁，例如氧運(yùn)輸牵祟，免疫防御和組織重塑。這一相當(dāng)大的工作由罕見的自我更新造血干細(xì)胞（HSCs）維持抖格，該干細(xì)胞維持在由瘦蛋白受體陽性（LEPR +）的間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞組成的特化骨髓微環(huán)境中诺苹。先前已提出成骨細(xì)胞支持早期淋巴祖細(xì)胞存活和維持。交感神經(jīng)纖維細(xì)胞雹拄，巨噬細(xì)胞收奔，巨核細(xì)胞和非髓鞘化施萬細(xì)胞提供額外的信號(hào)（細(xì)胞因子），這也有助于HSC龕滓玖。前期的研究表明坪哄，骨髓結(jié)構(gòu)中存在有血管細(xì)胞和間質(zhì)干細(xì)胞介導(dǎo)的更深程度的細(xì)胞復(fù)雜性正歼。
? ? ? 必須以精確和快速的方式控制造血，來滿足體內(nèi)穩(wěn)態(tài)和環(huán)境壓力條件的不同需求求橄。盡管我們對(duì)骨髓龕的理解在過去幾十年中已經(jīng)有了很大的發(fā)展传透，但是解決骨髓微環(huán)境的分子異質(zhì)性和功能可塑性的研究仍然有限，這主要是由于骨髓中靶標(biāo)細(xì)胞的數(shù)量太少及分離技術(shù)的局限性粉私。在本研究中，我們分析了小鼠骨髓龕中的17,374個(gè)單細(xì)胞，識(shí)別出了骨髓微環(huán)境中以前未被認(rèn)識(shí)到的異質(zhì)性绷蹲，并揭示了微環(huán)境是如何在單細(xì)胞水平對(duì)急性骨髓應(yīng)激作出反應(yīng)。我們將轉(zhuǎn)錄分析與熒光報(bào)告基因和功能研究相結(jié)合顾孽，來證明我們的單細(xì)胞研究所鑒定的Notch受體DLL4的血管表達(dá)抑制了HSC中髓樣程序的過早上調(diào)祝钢。
骨髓龕的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析
為了得到骨髓龕主要的細(xì)胞亞群，作者構(gòu)建了三種條件敲除的小鼠若厚，分別標(biāo)記不同的細(xì)胞類群：
VE-Cad–tdTomato標(biāo)記脈管類細(xì)胞拦英、LEPR–tdTomato標(biāo)記LEPR+陽性的細(xì)胞、COL2.3–tdTomato標(biāo)記成骨細(xì)胞
【The?VEcad-cre;LoxP-tdTomato?(VEcad?is also known as?Cdh5) (VE-Cad–tdTomato) model was used to label vasculature;?Lepr-cre;LoxP-tdTomato?(LEPR–tdTomato) was used to mark LEPR+?cells; and?Col2.3-cre;LoxP-tdTomato?(Col2.3?refers to?cre?adjoined to 2.3?kb of the?Col1a1?promoter) (COL2.3–tdTomato) was used to trace osteoblasts (Extended Data Fig.?1a). 】
從酶分解消化標(biāo)記的骨髓中分離出CD45和TER119低表達(dá)测秸、tdTomato陽性的（CD45low TER119low tdTomato+ cells）細(xì)胞并進(jìn)行普通測(cè)序(bulk mRNA sequencing), 結(jié)果證明存在不同的轉(zhuǎn)錄類群疤估。
單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)檢測(cè)
選擇VE-Cad+ , LEPR+ 與COL2.3+ 陽性的細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞測(cè)序灾常，來研究骨髓龕細(xì)胞群體的轉(zhuǎn)錄組多樣性。分析了正常狀態(tài)與氟尿嘧啶處理兩種條件下的小鼠細(xì)胞铃拇。分離骨髓龕的細(xì)胞钞瀑，構(gòu)建10Xgenomics文庫并測(cè)序。質(zhì)量過濾我們獲得了18339個(gè)細(xì)胞的數(shù)據(jù)慷荔。 采用比對(duì)的方法(We used an alignment method13?that was based on canonical correlation analysis (seeMethods) to correct for the observed batch effects between independent experiments (non-treated, and treated with PBS or 5-FU). We used?t-distributed stochastic neighbour embedding (t-SNE) and graph-based clustering to investigate cellular heterogeneity within the niche subsets. We removed 965 contaminating cells—most of which were haematopoietic cells—and used the remaining 17,374 cells for the analysis (see?Methods) (Extended Data Fig.?2a).)
為了檢測(cè)骨髓龕基準(zhǔn)的轉(zhuǎn)錄組雕什，作者僅選擇狀態(tài)穩(wěn)定的條件的細(xì)胞（n=9622）。在作者Cre模型中显晶，與組織特異性相關(guān)的基因表達(dá)表明骨髓龕細(xì)胞可以分成明顯的亞群贷岸。
作者識(shí)別出2個(gè)內(nèi)皮、4個(gè)血管周圍和3個(gè)骨細(xì)胞系的細(xì)胞亞群及一個(gè)小的（含70個(gè)細(xì)胞）增殖細(xì)胞簇 (Fig. 1c, d, Extended Data Fig. 1e)磷雇。作者僅關(guān)注骨髓龕的大的細(xì)胞亞群凰盔，還可以用于其他分析（數(shù)據(jù)挖掘黨的福音）。作者分別分析了內(nèi)皮細(xì)胞亞群倦春、管脈細(xì)胞亞群和骨細(xì)胞系亞群的特征和相關(guān)基因的檢測(cè)户敬。
基于整合或者獨(dú)立的兩種方法，從骨髓脈管系統(tǒng)內(nèi)鑒定出兩個(gè)主要的簇（聚類）睁本。為了獲得每個(gè)亞群的生物標(biāo)記尿庐，作者分別對(duì)每個(gè)亞群與其他類群進(jìn)行差異表分析。竇狀毛細(xì)血管的分支網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成骨髓中的大部分血管呢堰，而動(dòng)脈包含相對(duì)較少的側(cè)枝并沿著骨干縱向排列抄瑟。然后是骨髓龕中血竇中的基因鑒定和檢測(cè)。
? ? ? 鑒于LEPR+細(xì)胞群體具有多譜系分化潛能和間充質(zhì)干細(xì)胞活性枉疼，該細(xì)胞群體的異質(zhì)性一直是個(gè)懸而未決的問題皮假。作者通過綜合分析從LEPR+細(xì)胞群體中識(shí)別出4個(gè)明顯的簇（P1、P2骂维、P3惹资、P4）。P1 (Mgphigh )和P2(Lplhigh ) 簇表達(dá)成脂相關(guān)的標(biāo)記基因航闺。
分析正常組的LEPR+細(xì)胞群體有明顯的和3個(gè)（P1褪测、P3和P4）簇，結(jié)合分析處理組得到P2簇（一個(gè)成脂前體細(xì)胞狀態(tài)而非一個(gè)祖細(xì)胞）潦刃。P3 (Wif1high) 和P4 (Spp1highIbsphigh)為L(zhǎng)EPR+細(xì)胞群體中成骨蓄勢(shì)待發(fā)的類群侮措，因?yàn)槌晒窍嚓P(guān)的基因的表達(dá)水平隨著時(shí)間日益增高。LEPR+細(xì)胞群體表達(dá)P3和P4簇的特異性基因標(biāo)記CD200（由Cd200編碼）和CD63（由Cd小梁63編碼）乖杠，該標(biāo)記主要位于骨部分分扎。
COL2.3+細(xì)胞類群可以由其轉(zhuǎn)錄本分為三個(gè)亞群。簇O1（Col16a1highTnnhigh）表達(dá)高水平的破骨細(xì)胞（由Ostn編碼）和血管生成素樣2（由Angptl2編碼）胧洒，以及DEL-1（由Edil3編碼）畏吓，其最近研究已證明其可調(diào)節(jié)骨髓細(xì)胞生成环揽。亞群O2（Fbn1highIgf1high;擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖5a）既表達(dá)成骨細(xì)胞也表達(dá)軟骨細(xì)胞特異性基因。 簇O2與表面標(biāo)記CD9相關(guān)庵佣。由于簇O3（BglaphighCar3high）顯示出COL2.3（Col1a1）和成骨相關(guān)基因的最高表達(dá)歉胶，它代表成熟的成骨細(xì)胞（圖2c，擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖5a）
骨髓龕中的造血因子前體
作者從對(duì)管脈細(xì)胞亞群分析中巴粪，發(fā)現(xiàn)血管細(xì)胞表達(dá)最高水平的血管生成素（由Ang編碼）通今，δ樣Notch配體（具體地，由Dll4和Dll1編碼的那些）和選擇蛋白E（由Sele編碼）肛根。在管脈細(xì)胞亞群內(nèi)辫塌，動(dòng)脈簇V1富含SDF-1（由Cxcl12編碼）和SCF（由Kit1編碼）。作者隨后分析了LEPR+細(xì)胞群體和COL2.3+細(xì)胞類群中造血相關(guān)因子的表達(dá)情況（圖4）派哲。
骨髓龕的應(yīng)激反應(yīng)特征
常用于治療白血病的化學(xué)療法會(huì)導(dǎo)致造血祖細(xì)胞的消耗臼氨，并誘導(dǎo)其他靜默狀態(tài)造血干細(xì)胞的增殖和分化。骨髓消耗影響竇狀血管和基質(zhì)細(xì)胞芭届，并導(dǎo)致骨髓脂肪細(xì)胞的增加储矩。為了研究急性應(yīng)激條件下骨髓龕的動(dòng)態(tài)分子和形態(tài)變化，作者給予單劑量的5-氟尿嘧啶（150 mg.kg -1）褂乍。 在治療后第5天持隧，檢測(cè)到骨髓細(xì)胞數(shù)，Lineage（Lin）-SCA-1 +CD117 +（LSK）骨髓細(xì)胞以及骨髓血管和血管周圍細(xì)胞總數(shù)的顯著下降逃片。
為了追蹤應(yīng)激性造血過程中骨髓龕中基因表達(dá)的變化屡拨，我們用5-氟尿嘧啶處理了7,752個(gè)細(xì)胞（圖3）
結(jié)果表明脂肪細(xì)胞引發(fā)的簇（P5，n = 161）（圖3b褥实，擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖6d）的形成以及整個(gè)LEPR+和COL2.3+群體中簇貢獻(xiàn)的變化呀狼。
5-氟尿嘧啶處理后的LEPR+細(xì)胞群體，脂肪相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)损离，成骨相關(guān)的基因表達(dá)下調(diào)哥艇。
5-氟尿嘧啶處理后對(duì)造血因子的影響。上調(diào)的基因有：vascular Ang, perivascular Il7 and Bmp4 and osteo Wnt5a草冈；下調(diào)的的基因有：vascular Notch delta-like ligands Dll4 and Dll1, the adhesion molecule Sele and perivascular Wnt4她奥。
血管內(nèi)皮細(xì)胞的Notch配體
作者的分析顯示Notch配體Dll1和Dll4在VE-Cad+細(xì)胞中特異性表達(dá)（圖2f）。定量PCR驗(yàn)證Notch配體Dll1和Dll4在血管內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)怎棱。并且刺激條件下Dll1和Dll4表達(dá)顯著下降。之前的研究已經(jīng)確定靶向造血細(xì)胞中的Notch-受體信號(hào)通路在正常造血中的關(guān)鍵作用绷跑。然而Notch的配體在骨髓中的作用仍不清楚拳恋。
為了檢測(cè)Notch的配體在骨髓中的作用，培育了報(bào)告基因（共表達(dá)Notch配體砸捏，由Dll1, Dll4 or Jag1編碼）和熒光標(biāo)記的mCherry的轉(zhuǎn)基因小鼠谬运。熒光顯微鏡觀察結(jié)果表明隙赁，Dll1和Dll4在胸腺表皮表達(dá)，Jag1在胸腺髓內(nèi)表達(dá)梆暖。
通過血管DLL4表達(dá)調(diào)節(jié)HSPCs(造血干細(xì)胞和造血祖細(xì)胞)
為了進(jìn)一步研究血管DLL4在正常造血中的作用伞访，我們?cè)u(píng)估了Dll4的血管-內(nèi)皮特異性缺失的影響。
我們稱之為VE-CadcreER-Dll4i3COIN轰驳。 在整個(gè)VE-Cad+血管區(qū)段中Dll4缺失后厚掷，我們檢測(cè)到Lin-SCA-1lowCD117lowFLT3 +IL7Rα+常見淋巴祖細(xì)胞的頻率降低以及Lin- SCA-1中骨髓祖細(xì)胞群的擴(kuò)增 - CD117 +FCγR+ CD34 +門（粒細(xì)胞 - 單核細(xì)胞祖細(xì)胞門），先前已報(bào)道含有混合譜系骨髓電位40-42（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖9a级解，b）冒黑。
討論
越來越多的證據(jù)表明偏離了傳統(tǒng)的造血分層模型，而是建議每個(gè)HSC能夠區(qū)分不同的譜系勤哗。 很有可能假設(shè)這樣的可塑性是由HSC和微環(huán)境的組成部分之間的獨(dú)特相互作用決定的抡爹。 我們的研究結(jié)果通過提供骨髓龕的不同血管，血管周圍和骨系組成部分的詳細(xì)轉(zhuǎn)錄藍(lán)圖芒划，擴(kuò)展了對(duì)骨髓龕的理解冬竟。
本研究，結(jié)果表明單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析可以轉(zhuǎn)化為機(jī)制明了干細(xì)胞和祖細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)民逼。 作者將造血因子與其細(xì)胞來源相匹配诱咏，并顯示血管-內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的Notch配體DLL4的缺失使骨髓造血傾向于HSPC的顯著的轉(zhuǎn)錄重編程和髓樣發(fā)生。 將來的研究需要研究骨髓龕異質(zhì)性對(duì)功能異常干細(xì)胞的影響缴挖，如免疫缺陷袋狞，造血系統(tǒng)惡性腫瘤和衰老。 靶向骨髓龕相關(guān)因子可能干擾疾病的發(fā)生和發(fā)展映屋，最近已經(jīng)有研究通過靶向急性淋巴細(xì)胞白血病中的血管CXCR4-CXCL12相互作用顯示出來苟鸯。
