scATAC分析神器ArchR初探-簡(jiǎn)介（1）
scATAC分析神器ArchR初探-ArchR進(jìn)行doublet處理（2）
scATAC分析神器ArchR初探-創(chuàng)建ArchRProject（3）
scATAC分析神器ArchR初探-使用ArchR降維（4）
scATAC分析神器ArchR初探--使用ArchR進(jìn)行聚類（5）
scATAC分析神器ArchR初探-單細(xì)胞嵌入（6）
scATAC分析神器ArchR初探-使用ArchR計(jì)算基因活性值和標(biāo)記基因（7）
scATAC分析神器ArchR初探-scRNA-seq確定細(xì)胞類型（8）
scATAC分析神器ArchR初探-ArchR中的偽批次重復(fù)處理（9）
scATAC分析神器ArchR初探-使用ArchR-peak-calling（10）
scATAC分析神器ArchR初探-使用ArchR識(shí)別標(biāo)記峰（11）
scATAC分析神器ArchR初探-使用ArchR進(jìn)行主題和功能豐富(12)
scATAC分析神器ArchR初探-利用ArchR豐富ChromVAR偏差(13)
scATAC分析神器ArchR初探-使用ArchR進(jìn)行足跡（14）
scATAC分析神器ArchR初探-使用ArchR進(jìn)行整合分析（15）
scATAC分析神器ArchR初探-使用ArchR進(jìn)行軌跡分析（16）

4-使用ArchR降維

由于稀疏性姆另，使用scATAC-seq降低尺寸具有挑戰(zhàn)性的數(shù)據(jù)储耐。在scATAC-seq中果元，可以在一個(gè)等位基因（兩個(gè)等位基因或一個(gè)等位基因）上訪問(wèn)特定位點(diǎn)。即使在高質(zhì)量的scATAC-seq數(shù)據(jù)中邻悬，大多數(shù)可訪問(wèn)區(qū)域也不會(huì)轉(zhuǎn)座搏明，這導(dǎo)致許多具有0個(gè)可訪問(wèn)等位基因的基因座省艳。此外，當(dāng)我們?cè)趩蝹€(gè)單元格的單個(gè)峰區(qū)域內(nèi)看到（例如）三個(gè)Tn5插入片段時(shí)颁股，數(shù)據(jù)的稀疏性使我們無(wú)法自信地確定該單元格中的該位點(diǎn)實(shí)際上比只有一個(gè)單元格的另一個(gè)單元格高出三倍在同一站點(diǎn)插入一個(gè)。因此傻丝，許多分析策略都對(duì)二進(jìn)制化的scATAC-seq數(shù)據(jù)矩陣起作用甘有。由于轉(zhuǎn)置很少，因此該二值化矩陣最終仍大部分為0葡缰。然而亏掀，重要的是要注意，scATAC-seq中的0可能表示“不可訪問(wèn)”或“未采樣”泛释，并且從生物學(xué)的角度來(lái)看滤愕，這兩個(gè)推論有很大不同。因此怜校，1具有信息间影，而0沒(méi)有。如此低的信息量是我們的scATAC-seq數(shù)據(jù)的來(lái)源稀疏的茄茁。

如果要在此稀疏插入計(jì)數(shù)矩陣上執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)降維（例如主成分分析）并繪制前兩個(gè)主成分魂贬，則將無(wú)法獲得所需的結(jié)果，因?yàn)橄∈栊詫?dǎo)致所有0都具有較高的小區(qū)間相似度職位胰丁。為了解決這個(gè)問(wèn)題随橘，我們使用分層降維方法喂分。首先锦庸，我們使用潛在語(yǔ)義索引（LSI），這是自然語(yǔ)言處理中的一種方法蒲祈，最初旨在根據(jù)字?jǐn)?shù)評(píng)估文檔的相似性甘萧。該解決方案是為自然語(yǔ)言處理而創(chuàng)建的，因?yàn)閿?shù)據(jù)稀疏且嘈雜（許多不同的單詞和許多低頻單詞）梆掸。LSI由Cusanovich等人首次針對(duì)scATAC-seq引入扬卷。（2015年科學(xué)）。對(duì)于scATAC-seq酸钦，不同的樣本是文檔怪得，不同的區(qū)域/峰是單詞。首先卑硫，我們通過(guò)每個(gè)單元的深度歸一化來(lái)計(jì)算頻率項(xiàng)徒恋。然后欢伏，通過(guò)反文檔頻率對(duì)這些值進(jìn)行歸一化入挣，反文檔頻率通過(guò)對(duì)特征進(jìn)行加權(quán)的頻率來(lái)對(duì)特征進(jìn)行加權(quán)，以識(shí)別更“特定”而不是通诚跖。可訪問(wèn)的特征径筏。最終的詞頻-反文檔頻率（TF-IDF）矩陣反映了單詞（即區(qū)域/峰值）對(duì)文檔（即樣本）的重要性葛假。然后，通過(guò)一種叫做奇異值分解（SVD）滋恬，最有價(jià)值跨樣本的信息被識(shí)別并在較低維度的空間中表示聊训。LSI使您可以將稀疏插入計(jì)數(shù)矩陣的維數(shù)從數(shù)千減少到數(shù)十或數(shù)百。然后恢氯，可以使用更常規(guī)的降維技術(shù)魔眨，例如均勻流形近似和投影（UMAP）或t分布隨機(jī)鄰居嵌入（t-SNE），將數(shù)據(jù)可視化酿雪。在ArchR中遏暴，這些可視化方法稱為嵌入。

4.1 ArchR的LSI實(shí)現(xiàn)

ArchR實(shí)現(xiàn)了幾種不同的LSI實(shí)現(xiàn)指黎，我們已經(jīng)在多個(gè)不同的測(cè)試數(shù)據(jù)集中對(duì)許多方法進(jìn)行了基準(zhǔn)測(cè)試朋凉。ArchR的默認(rèn)LSI實(shí)現(xiàn)與Timacy Stuart在Signac中引入的方法有關(guān)，該方法使用的術(shù)語(yǔ)頻率已被深度歸一化為常數(shù)（10,000）醋安，然后使用反文檔頻率進(jìn)行歸一化杂彭，然后對(duì)結(jié)果矩陣進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換（aka log(TF-IDF)）。

降低LSI尺寸的關(guān)鍵輸入之一是起始矩陣吓揪。到目前為止亲怠，scATAC-seq中的兩個(gè)主要策略是（1）使用峰區(qū)域或（2）全基因組圖塊。但是柠辞，將峰區(qū)域用于LSI本身就具有挑戰(zhàn)性团秽，因?yàn)樵诮稻S之前我們沒(méi)有簇或簇特定峰。此外叭首，在聚類之前在聚集的細(xì)胞上調(diào)用峰會(huì)掩蓋特定于細(xì)胞類型的峰习勤。而且，將新樣品添加到實(shí)驗(yàn)中時(shí)焙格，任何聯(lián)合峰集都會(huì)改變图毕，從而使該策略的穩(wěn)定性降低。第二種策略是使用全基因組切片眷唉，通過(guò)使用一致且無(wú)偏的特征集（全基因組切片）來(lái)緩解這些問(wèn)題予颤。但是，所有區(qū)域中所有細(xì)胞的全基因組圖塊矩陣可能會(huì)變得過(guò)大冬阳。為此原因蛤虐，大多數(shù)實(shí)現(xiàn)都使用大于或等于5 KB的小塊。因?yàn)榇蠖鄶?shù)可訪問(wèn)區(qū)域只有幾百個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)摩泪，所以這大大降低了方法的分辨率笆焰。

由于Arrow文件的設(shè)計(jì)方式，ArchR能夠使用全基因組范圍的500 bp切片快速執(zhí)行LSI见坑。這解決了分辨率問(wèn)題嚷掠，并允許在調(diào)用峰之前識(shí)別簇捏检。挑戰(zhàn)在于，500 bp的條帶生成約600萬(wàn)個(gè)特征不皆，并按圖塊矩陣包含在單元中贯城。雖然ArchR可以通過(guò)分塊相關(guān)矩陣將大量數(shù)據(jù)讀取到R中，但我們還實(shí)現(xiàn)了“估計(jì)LSI”方法霹娄，該方法對(duì)所有單元的子集執(zhí)行初始降維能犯。這種估計(jì)的LSI方法具有兩個(gè)主要用途-（i）加快降維速度；（ii）減少初始降維時(shí)使用的單元數(shù)犬耻，這會(huì)降低數(shù)據(jù)的粒度踩晶。粒度的減少可用于您的優(yōu)勢(shì)，以減少數(shù)據(jù)中的批量影響枕磁。但是渡蜻，它也可能掩蓋真實(shí)的生物學(xué)信息，因此應(yīng)在密切的人工監(jiān)督下使用估計(jì)的LSI方法计济。

4.2迭代潛在語(yǔ)義索引（LSI）

在scRNA-seq中茸苇，識(shí)別可變基因是計(jì)算降維的常用方法（例如PCA）。這樣做是因?yàn)檫@些高度可變的基因在生物學(xué)上更可能具有重要意義沦寂，并且可以減少實(shí)驗(yàn)噪音学密。在scATAC-seq中，數(shù)據(jù)是二進(jìn)制的传藏，因此您無(wú)法識(shí)別可變峰以降低維數(shù)腻暮。我們沒(méi)有確定最大的峰，而是嘗試使用最易訪問(wèn)的功能作為L(zhǎng)SI的輸入漩氨。但是西壮，運(yùn)行多個(gè)樣品時(shí)的結(jié)果顯示出較高的噪聲水平和低重現(xiàn)性遗增。為了解決這個(gè)問(wèn)題叫惊，我們引入了``迭代LSI''方法（Satpathy *，Granja *等人做修，Nature Biotechnology 2019和Granja *霍狰，Klemm *和McGinnis *等人，Nature Biotechnology 2019）饰及。此方法在最易訪問(wèn)的圖塊上計(jì)算初始LSI轉(zhuǎn)換蔗坯，并標(biāo)識(shí)沒(méi)有批次混淆的較低分辨率的群集。例如燎含，當(dāng)對(duì)外周血單核細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)時(shí)宾濒，這將鑒定出與主要細(xì)胞類型（T細(xì)胞，B細(xì)胞和單核細(xì)胞）相對(duì)應(yīng)的簇屏箍。然后绘梦，ArchR計(jì)算所有要素中所有這些集群的平均可訪問(wèn)性橘忱。然后，ArchR識(shí)別這些群集中變化最大的峰卸奉，并將這些功能再次用于LSI钝诚。在第二次迭代中，變化最大的峰與scRNA-seq LSI實(shí)現(xiàn)中使用的變化基因更加相似榄棵。用戶可以設(shè)置應(yīng)執(zhí)行的LSI迭代次數(shù)凝颇。

在本教程中佛猛，我們將創(chuàng)建一個(gè)reducedDims名為“ IterativeLSI” 的對(duì)象。

projHeme2 <- addIterativeLSI(
    ArchRProj = projHeme2,
    useMatrix = "TileMatrix", 
    name = "IterativeLSI", 
    iterations = 2, 
    clusterParams = list( #See Seurat::FindClusters
        resolution = c(0.2), 
        sampleCells = 10000, 
        n.start = 10
    ), 
    varFeatures = 25000, 
    dimsToUse = 1:30
)

如果您在下游看到具有細(xì)微的批處理效果坠狡，則另一個(gè)選擇是添加更多的LSI迭代继找，并從較低的初始群集分辨率開(kāi)始，如下所示逃沿。另外婴渡，可變特征的數(shù)量可以減少以增加對(duì)更多可變特征的關(guān)注。

reducedDims為了說(shuō)明的目的凯亮，我們將該對(duì)象命名為“ IterativeLSI2”边臼，但我們不會(huì)在下游使用它。

projHeme2 <- addIterativeLSI(
    ArchRProj = projHeme2,
    useMatrix = "TileMatrix", 
    name = "IterativeLSI2", 
    iterations = 4, 
    clusterParams = list( #See Seurat::FindClusters
        resolution = c(0.1, 0.2, 0.4), 
        sampleCells = 10000, 
        n.start = 10
    ), 
    varFeatures = 15000, 
    dimsToUse = 1:30
)

4.3估計(jì)的LSI

對(duì)于非常大的scATAC-seq數(shù)據(jù)集假消，ArchR可以估計(jì)帶有LSI投影的LSI維數(shù)減少柠并。此過(guò)程與迭代LSI工作流程相似，但是LSI過(guò)程不同。首先臼予，將隨機(jī)選擇的“地標(biāo)”單元的子集用于LSI降維亿傅。其次，使用從界標(biāo)單元確定的反文檔頻率對(duì)其余單元進(jìn)行TF-IDF歸一化瘟栖。第三葵擎，將這些歸一化的單元投影到由界標(biāo)單元定義的SVD子空間中。這導(dǎo)致了基于一小部分單元的LSI轉(zhuǎn)換半哟，這些單元被用作剩余單元的投影的界標(biāo)酬滤。這種估計(jì)的LSI程序?qū)τ贏rchR是有效的，因?yàn)樵趯⑿聠卧队暗浇鐦?biāo)單元LSI中時(shí) ArchR迭代地從每個(gè)樣本讀取單元寓涨，而LSI將其投影而不將其全部存儲(chǔ)在內(nèi)存中盯串。這種優(yōu)化導(dǎo)致最小的內(nèi)存使用，并進(jìn)一步提高了超大型數(shù)據(jù)集的可伸縮性戒良。重要的是体捏，所需的界標(biāo)集大小取決于數(shù)據(jù)集中不同像元的比例。

addIterativeLSI()通過(guò)設(shè)置sampleCellsFinal和projectCellsPre參數(shù)糯崎，可以通過(guò)功能在ArchR中訪問(wèn)估計(jì)的LSI 几缭。samplesCellsFinal指定界標(biāo)單元格子集的大小，并projectCellsPre告訴ArchR使用此界標(biāo)單元格子集進(jìn)行其余單元格的投影沃呢。

4.4通過(guò)諧波校正批效應(yīng)

有時(shí)年栓，迭代LSI方法不足以解決強(qiáng)批處理差異。因此薄霜，ArchR實(shí)現(xiàn)了一種常用的批處理校正工具Harmony某抓，該工具最初是為scRNA-seq設(shè)計(jì)的。我們提供了一個(gè)包裝器惰瓜，該包裝器會(huì)將降維對(duì)象從ArchR直接傳遞給HarmonyMatrix()函數(shù)否副。附加參數(shù)可以HarmonyMatrix()通過(guò)附加參數(shù)（...）直接傳遞到函數(shù)中。請(qǐng)參閱?addHarmony()以獲取更多詳細(xì)信息崎坊。用戶應(yīng)了解針對(duì)其特定應(yīng)用的批處理糾正的注意事項(xiàng)备禀。

projHeme2 <- addHarmony(
    ArchRProj = projHeme2,
    reducedDims = "IterativeLSI",
    name = "Harmony",
    groupBy = "Sample"
)

參考材料：

https://www.archrproject.com/