? ? ? ? 基因克禄（gene cloning）或分子克隆,又稱為重組DNA技術(shù)，是應(yīng)用酶學(xué)方法白华，在體外將不同來源的DNA分子通過酶切、連接等操作重新組裝成雜合分子贩耐，并使之在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中進行擴增弧腥，形成大量的子代DNA分子的過程。例如,要獲得人類基因組中的某個基因潮太，我們就需要借助基因克隆技術(shù)管搪，進行目的基因的分離、克隆和擴增铡买。因此更鲁，接下來，我就從基因克隆工具和具體的實驗流程兩方面進行介紹奇钞。

基因克隆工具

（1）限制性內(nèi)切酶

????????首先介紹的是限制性核酸內(nèi)切酶岁经，它是細(xì)菌的“限制-修飾系統(tǒng)”防御機制的重要一員。限制修飾系統(tǒng)(Restriction-Modification System, R-M system )蛇券，即限制酶和甲基化酶系統(tǒng)（圖1） [1]缀壤。研究者將能識別并切斷外來DNA分子的某些部位，使外來DNA失去活性纠亚，限制外來噬菌體的繁殖的酶稱為限制性核酸內(nèi)切酶（Restriction endonuclease塘慕，RE，簡稱限制性內(nèi)切酶或限制酶）蒂胞。而宿主細(xì)菌的DNA通過甲基化酶的甲基化后图呢，DNA的酶切位點被保護起來，不會被限制酶切割。

圖1. 細(xì)菌的防御機制：“限制-修飾系統(tǒng)”

????????根據(jù)限制性內(nèi)切酶的結(jié)構(gòu)蛤织，識別位點赴叹，切割位點等特性可以將RE分成四類（表1）[2]，基因克隆中常用的是II型限制性內(nèi)切酶指蚜。不過像IV型內(nèi)切酶這種可以識別修飾化DNA乞巧，可以用于表觀遺傳學(xué)的研究。

表1.限制性內(nèi)切酶分類[2]

????????II型限制性內(nèi)切酶是目前發(fā)現(xiàn)的最多的一類內(nèi)切酶摊鸡，根據(jù)其識別位點與切割位點的特性又可以分成不同的亞型[3]绽媒，例如我們常見的識別回文序列的內(nèi)切酶，EcoR I免猾，屬于Type IIP類型是辕，這種酶的切割位點在識別位點內(nèi)部；而像現(xiàn)在在CRISPR/Cas9相關(guān)基因克隆中用到的Bpi I等酶猎提，則屬于Type IIS型获三，它的切割位點離識別位點有幾個到幾十個堿基的距離。

圖2. II型限制性內(nèi)切酶分類[3]

????????既然是限制性內(nèi)切酶锨苏，那么酶切DNA后就會留下不同的末端類型石窑，這其中就包括粘性末端和平末端（圖3）。所謂的粘性末端蚓炬，就是酶切后有5’端或者3’端有突出堿基的末端類型松逊，因此又分為5’ Overhang end，例如Hind III肯夏，和3’ Overhang end经宏， 例如Pst I兩種。那些酶切后沒有突出堿基的就屬于平末端類型驯击， 例如EcoR V烁兰。

圖3. 酶切末端類型

????????DNA堿基之間靠5’, 3’ 磷酸二酯鍵連接，限制性內(nèi)切酶切割DNA后徊都，出現(xiàn)的是5’-P 和3’-OH（圖4）沪斟。

圖4.限制性內(nèi)切酶水解DNA產(chǎn)生5’-P和3’-OH

????????另外，根據(jù)限制性內(nèi)切酶的功能暇矫，其又有同裂酶主之、異裂酶、同尾酶李根、可變酶和修飾敏感內(nèi)切酶等類型（圖5）槽奕。其中，同裂酶(isoschizomer)房轿，又稱異源同工酶粤攒，即從不同原核生物中分離出來的不同的Ⅱ型酶所森，有相同的識別特點和切割位點，例如Age I和BshT I夯接。異裂酶則是指可以識別相同的核苷酸序列焕济，但會在不同的位點切割 DNA，例如Sma I和Xma I盔几。同尾酶(isocaudarmer)指不同來源的酶其識別和切割序列有一定的相關(guān)性晴弃，作用后能產(chǎn)生相同的粘性末端，例如Age I和Xma I问欠，這一類的酶酶切后的產(chǎn)物可以進行連接，在基因克隆中有著重要的用途粒蜈∷诚祝可變酶則指所識別DNA序列中的一個或幾個堿基是可變的，并且識別序列往往超過6個堿基對枯怖，例如BstE II識別序列為：GGTNACC注整，其中N為一可變堿基，可以是A/T/C/G四種中的任何一個度硝；而BstN I 的識別序列為CCWGG肿轨，其中的W則表示A或者T。修飾敏感內(nèi)切酶是對DNA修飾（例如甲基化修飾）敏感的限制性內(nèi)切酶蕊程，例如Bcl I對甲基化的識別位點不能切割椒袍，但無甲基化的則可以進行切割；Dpn I則剛好相反藻茂，有甲基化才能切割驹暑。

圖5.不同類型限制性內(nèi)切酶示例

????????限制性內(nèi)切酶有那么多種，到底選擇那種進行呢辨赐？

????????首先优俘，我們需要進行酶切位點分析，可以使用在線（Sequence Manipulation Suite和analyze-sequence,Addgene）或者本地版（SnapGene）的分析工具進行序列分析掀序。然后結(jié)合同裂酶帆焕、異裂酶、同尾酶不恭、可變酶特性進行RE選擇叶雹，并且同時要考慮所選限制性內(nèi)切酶對修飾敏感性。另外换吧，根據(jù)試劑使用中使用的酶的數(shù)量浑娜，我們將酶切反應(yīng)可以分為單酶切、雙酶切和分步酶切式散。單酶切：同一個體系進行一種酶切反應(yīng)筋遭；雙酶切：同一個體系進行兩種酶的酶切反應(yīng)（針對反應(yīng)條件一致的限制性內(nèi)切酶）；分步酶切：樣品進行完第一個酶切反應(yīng)后進行純化，再進行第二個酶切反應(yīng)（針對反應(yīng)條件不一樣的限制性內(nèi)切酶）漓滔。明確了以上信息后编饺，我們就可以進行酶切反應(yīng)了。一個酶切反應(yīng)涉及樣品類型响驴，緩沖液透且，酶量以及反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間等。這些都可以參考限制性內(nèi)切酶的產(chǎn)品使用說明進行操作豁鲤。

（2）DNA連接酶

????????限制性內(nèi)切酶負(fù)責(zé)將DNA切開秽誊，DNA連接酶則是用來重新連接DNA的工具。DNA連接酶是一類催化雙鏈DNA中相鄰堿基的5’磷酸和3’羥基間磷酸二酯鍵形成的酶（圖6）琳骡。因為是雙鏈锅论，所以一般要求連接位點不能出現(xiàn)堿基錯配。不過實際應(yīng)用中楣号，DNA連接酶也會將有少量錯配的DNA進行連接最易。DNA連接酶主要有兩種：T4 DNA連接酶（平末端和粘性末端均可連接），大腸桿菌DNA連接酶（只能連接粘性末端）炫狱。

圖6. DNA連接酶機制

（3）DNA聚合酶

之前我們介紹過PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)藻懒，其中使用的就是DNA聚合酶。實際上视译，DNA聚合酶長具備三種酶活性（圖7）：用于新鏈DNA合成的DNA聚合酶活性嬉荆，用于錯誤參入堿基校正的3’-5’核酸外切酶活性，還有5’-3’ 核酸外切酶活性酷含，在DNA復(fù)制中用于去除RNA 引物员寇。借助這一活性，可以進行Nick translation第美，用于標(biāo)記核苷酸參入等蝶锋。但并不是每一種DNA聚合酶都這三種酶活性，NEB官網(wǎng)提供了一系列DNA聚合酶及其具備的功能活性（DNA Polymerase Selection Chart-NEB）什往。

圖7.DNA聚合酶的功能活性

????????根據(jù)所使用的DNA聚合酶類型不同扳缕，PCR產(chǎn)物的末端有3’-A粘性末端和平末端兩種類型。其中Taq DNA polymerase因為缺乏3’-5’ exonuclease活性别威，其PCR的保真度低躯舔，且PCR產(chǎn)物的3’端多一個粘性末端A；而 高保真DNA polymerase保留3’-5’ exonuclease活性省古，有很高的校正活性粥庄，其PCR產(chǎn)物為平末端。

圖8. PCR產(chǎn)物末端類型

（4）無縫克隆技術(shù)

????????除了上面介紹的用于傳統(tǒng)基因克隆中國的相關(guān)工具外豺妓，研究者開發(fā)了新型的基于插入片段和線性化載體的末端進行同源重組的基因克隆技術(shù)惜互，即無縫克隆技術(shù)（Seamless Cloning）布讹，主要包括Gibson Assembly[4]和Getway Clone兩種。這里我們重點介紹其中的Gibson Assembly训堆。

????????Gibson Assembly技術(shù)包含了DNA 5' 外切酶(5' Exonuclease)描验、DNA聚合酶(DNA Polymerase)和DNA連接酶(DNA Ligase)活性的重組酶(assembly enzyme)，通過同源重組的方法可以將一個或多個DNA片段按照預(yù)定方向坑鱼、快速膘流、高效和精確地插入到線性化載體中，并且最終構(gòu)建的克隆沒有任何額外的堿基序列鲁沥，因此被稱作“無縫克隆”呼股。如圖9中Gibson Assembly所示，紅色和綠色2個片段為需要連接的雙鏈DNA片段画恰，它們末端有相同的15-25個重疊序列（黑色）彭谁，首先在50℃條件下，T5 exonuclease核酸外切酶降解5’端的一些堿基阐枣，形成3’端突出的單鏈马靠，3’端單鏈互補退火奄抽；然后Phusion高保真聚合酶補上兩條單鏈之間的缺口蔼两；最后Taq DNA ligase將相鄰的單鏈切口連接補齊形成完整的DNA雙鏈（圖6）。

????????在Gibson Assembly基礎(chǔ)上逞度，研究者開發(fā)了TEDA[5]额划，僅添加T5 exonuclease核酸外切酶同樣可以實現(xiàn)重組克隆，它與借助細(xì)胞體內(nèi)的DNA修復(fù)機制進行缺損DNA的修復(fù)（圖6）档泽。

圖9.無縫克隆技術(shù)原理

（5）工具載體

????????接下來我們介紹基因克隆中常用的工具載體俊戳。按照功能分，載體分為克隆載體和表達載體（表2）馆匿。其中克隆載體含有能在原核細(xì)胞中復(fù)制的元件抑胎，用來克隆和擴增基因；表達載體除了具備克隆載體的基本元件外渐北，還具有轉(zhuǎn)錄/翻譯所必須的DNA順式元件阿逃。以下，我們將以SnapGene或addgene分析的載體結(jié)構(gòu)圖進行相關(guān)功能元件的說明赃蛛。

表2.載體類型

? ? ? ?以pUC19為例恃锉，說明克隆載體中的功能元件（圖10）。

圖10.pUC19載體圖示

? ??????復(fù)制起始位點（Origin of replication呕臂，ORI）：ORI是一段DNA序列破托，質(zhì)粒復(fù)制的起始位置。DNA解螺旋酶可以作用于這段序列歧蒋，然后DNA的雙鏈被分開土砂，復(fù)制隨即開始州既。質(zhì)粒必須是能夠復(fù)制的，否則隨著細(xì)菌的生長瘟芝，質(zhì)粒的數(shù)量將會被迅速稀釋易桃。篩選標(biāo)記，主要指抗生素抗性基因锌俱。在含有抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌晤郑，能夠生長的就是含有目的質(zhì)粒，因為贸宏，不含質(zhì)粒的細(xì)菌已經(jīng)被“殺死”了造寝，原核中常用的抗性篩選基因有Amp和Kan。LacZ：β-半乳糖苷酶基因吭练，也是一種篩選標(biāo)記诫龙，用于藍(lán)白斑篩選。多克隆位點（multiple cloning site, MCS）鲫咽，這是一段短DNA片段签赃，包括多個限制性酶切的單一位點，便于外源基因的插入分尸。一般來說锦聊，外源DNA片段越長，越難插入箩绍，越不穩(wěn)定孔庭，轉(zhuǎn)化效率越低。

? ? ? ?以pcDNA3.1為例材蛛，說明表達載體中的功能元件（圖11）圆到。

圖11.pcDNA3.1圖示

? ? ? ????????表達載體pcDNA3.1除了有克隆載體相關(guān)元件，如復(fù)制起始位點Ori卑吭，原核篩選標(biāo)記Amp外芽淡，還有一些其他的功能元件，如表3所示豆赏。

表3.pcDNA3.1中的功能元件

????????表達載體主要用于表達蛋白或者RNA挣菲，例如現(xiàn)在基因編輯中常用的一個表達載體PX458（圖12），可以同時表達Cas9蛋白和sgRNA河绽。因此上面也會攜帶一些其他的功能元件（表4）己单。

圖12.PX458載體圖示

表4.PX458中的功能元件

????????上面介紹的pcDNA3.1和PX458均是瞬時表達載體并不能在人類等細(xì)胞中進行復(fù)制，隨著細(xì)胞的分裂耙饰，單個細(xì)胞中的質(zhì)粒不斷的被稀釋纹笼，因此這些載體只能起到瞬時表達的效果。而慢病毒表達載體則可以介導(dǎo)表達元件整合到人類細(xì)胞的基因組中苟跪，這些表達元件可以隨著基因組DNA的復(fù)制而復(fù)制廷痘，因此可以實現(xiàn)穩(wěn)定表達蔓涧。

????????我們常用的慢病毒載體是以HIV-1(人類免疫缺陷I型病毒)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體，攜帶有外源基因的慢病毒載體在慢病毒包裝質(zhì)粒笋额、細(xì)胞系的輔助下元暴，經(jīng)過病毒包裝成為有感染力的病毒顆粒，將其進行收集和濃縮后可直接感染宿主細(xì)胞或者動物模型兄猩，將外源基因有效地整合到宿主的染色體上茉盏，從而達到外源基因的持久性表達。我們以pGreenPuro為例說明慢病毒表達載體中一些關(guān)鍵的功能元件（圖13枢冤，表5）鸠姨。

圖13.pGreenPuro載體圖示

表5.pGreenPuro功能元件

（6）感受態(tài)細(xì)胞

????????感受態(tài)細(xì)胞是采用理化方法誘導(dǎo)過的細(xì)胞私恬，它可以吸收周圍環(huán)境中的DNA分子奏路。實驗室中我們常使用E. coli進行感受態(tài)細(xì)胞的制備古程，主要包括克隆用的感受態(tài)細(xì)胞和表達用的感受態(tài)細(xì)胞（圖14）虹菲。

????????如果僅僅是進行質(zhì)粒擴增，我們一般使用克隆感受態(tài)細(xì)胞鳍怨。如果要進行原核蛋白質(zhì)表達齿穗，我們則選擇表達感受態(tài)細(xì)胞涉波。并且感受態(tài)細(xì)胞的基因型也有很多類客扎，是通過不同基因的缺失形成的祟峦，因而使細(xì)胞具有不同的特性，以滿足不同的需要虐唠。例如搀愧，進行克隆載體和瞬轉(zhuǎn)表達載體的擴增惰聂，常選用E. coli DH5α疆偿，TOP10菌株；而慢病毒載體則一般選擇低重組率的E. coli Stbl3菌株搓幌。而對于非甲基化載體的擴增杆故，則需要選擇E. coli dam-/dcm-?等甲基化酶缺失的菌株。

圖14.感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化

2.?基因克隆流程

????????前面了解了基因克隆使用的相關(guān)工具酶和載體溉愁，接下來处铛，我們介紹基因克隆的實驗流程。細(xì)分的話拐揭，包括以下10個步驟（表6）撤蟆。

表6.基因克隆流程

? ? ? ? 下面我們以lncRNA PVT1的克隆和表達，分別采用T/A克隆堂污，傳統(tǒng)酶切-酶連克隆和無縫克隆進行示例家肯。

表7.PVT1的克隆與表達

(1)?T/A克隆

????????T/A克隆是把PCR片段與一個具有3’-T突出的載體DNA連接起來的方法（圖15）。使用該方法進行基因克隆時不需要考慮酶切位點問題盟猖，但需要選擇Taq DNA聚合酶進行PCR擴增讨衣，其產(chǎn)物的3’端才會多一個突出的A换棚；此外，T/A克隆選用商業(yè)化的T載體反镇，其為線性化的載體固蚤，在3’端有一個突出的T；并且基因片段連入T載體是沒有方向性的歹茶，正反都有可能夕玩。

圖15.T/A克隆實驗流程

????????我們首先從NCBI上獲取PVT1（human）的基因序列信息（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MG562504.1），然后使用SnapGene等進行PCR引物設(shè)計（圖16）惊豺。以PVT1全長序列（1081nt）為模板风秤，設(shè)計的引物正向引物的5’端與PVT1序列的5’端相同，反向引物的5’端與PVT1序列的3’端互補扮叨。然后使用Taq DNA 聚合酶缤弦，以細(xì)胞的cDNA為模板進行PCR，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳或割膠回收目的大小片段（圖17）彻磁。

圖16. T/A克隆PVT1的引物設(shè)計（SnapGene）

圖17.DNA電泳與割膠回收

? ? ? ?膠回收的基因片段與商業(yè)化的T載體（pMD-18T）連接碍沐，形成重組DNA載體pMD18-PVT1（圖18），經(jīng)轉(zhuǎn)化（圖19）和菌落PCR（圖20）后篩選到候選陽性克隆衷蜓，再使用Sanger測序（圖21）進行插入序列的鑒定累提，獲得陽性克隆。

圖18.T/A克隆——連接

圖19.轉(zhuǎn)化

圖20.菌落PCR

圖21.Sanger測序

（2）傳統(tǒng)酶切-酶連克隆

????????傳統(tǒng)酶切-酶連克隆主要是采用相同的限制性內(nèi)切酶（或者同尾酶）分別酶切載體和基因片段磁浇，然后使用DNA連接酶進行連接斋陪，轉(zhuǎn)化。以下置吓，我們同樣以PVT1為例无虚，將其使用傳統(tǒng)方法克隆至pcDNA3.1表達載體上。

????????我們在獲得PVT1的基因全長序列后衍锚，需要首先進行酶切位點分析友题，例如使用SnapGene進行常用6堿基識別位點的限制性內(nèi)切酶位點分析（圖22）。同時戴质，我們分析pcDNA3.1中MCS中可用的酶切位點度宦，我們排除PVT1有的限制性內(nèi)切酶并排除同尾酶（避免載體的自連），即可得到可用的限制性內(nèi)切酶告匠。在這里我們選擇Nhe I和EcoR I（圖23）戈抄。

圖22. PVT1酶切位點分析

圖23.pcDNA3.1中MCS圖示

????????接下來，我們以PVT1的全長序列為模板設(shè)計克隆引物（SnapGene設(shè)計的引物序列與T/A克隆中一樣）后专，不過我們還要在引物的5’端添加選擇好的限制性內(nèi)切酶的酶切位點以及相應(yīng)的保護堿基（圖24）划鸽。同樣使用Taq DNA 聚合酶或者其他高保真DNA聚合酶，以細(xì)胞的cDNA為模板進行PCR行贪，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳或割膠回收目的大小片段漾稀。

圖24.PVT1引物設(shè)計模闲，酶切位點和保護堿基引入

? ? ? ?回收的PVT1 PCR產(chǎn)物和pcDNA3.1載體均使用Nhe I和EcoR I進行雙酶切，其中PVT1由于酶切后的序列為一個約1000bp的片段和一個約5bp的片段崭捍，無需進行割膠回收尸折，直接使用PCR產(chǎn)物純化柱進行酶切產(chǎn)物純化即可（圖25）。而pcDNA3.1的酶切由于可能存在未完全切開的質(zhì)粒（在后續(xù)轉(zhuǎn)化中會形成大量的假陽性克乱笊摺）实夹，需要進行瓊脂糖凝膠電泳，割取線性化的載體片段進行膠回收（圖25）粒梦。然后將PVT1和pcDNA3.1酶切片段使用DNA連接酶進行連接亮航，轉(zhuǎn)化。同樣匀们，使用菌落PCR和Sanger測序進行陽性克隆子pcDNA3.1-PVT1的篩選（圖26）缴淋。

圖25. PVT1和pcDNA3.1的雙酶切

圖26.PVT1和pcDNA3.1的連接

（3） 無縫克隆

無縫克隆的一個重要優(yōu)勢是不需要考慮待克隆片段中的酶切位點情況，因此直接選擇相應(yīng)的酶切位點將載體線性化后泄朴，根據(jù)載體的線性化末端進行同源引物的設(shè)計重抖，PCR擴增目的基因并純化后直接進行重組連接和轉(zhuǎn)化（圖27）。以下祖灰，我們同樣以PVT1克隆至pcDNA3.1載體為例進行說明钟沛。

圖27.無縫克隆實驗流程

? ? ? ?獲得PVT1和pcDNA3.1的全長序列后可以使用SnapGene，CE Design（Vazyme）和In-Fusion Clone（Takara）等在線或本地軟件進行同源臂引物的設(shè)計局扶。

圖28.PVT1的同源臂引物

? ? ? ?使用同源臂引物恨统，以細(xì)胞cDNA為模板，使用高保真DNA聚合酶為模板進行PCR三妈，膠回收相應(yīng)片段畜埋。pcDNA3.1載體使用Nhe I和EcoR I進行雙酶切后，割膠回收載體片段沈跨。然后添加無縫克隆試劑進行重組連接由捎，轉(zhuǎn)化后進行陽性克隆的篩選與鑒定兔综。

圖29.pcDNA3.1-PVT的無縫克隆

? ? ? ?而實際上饿凛，無縫克隆還有另外一個重要的優(yōu)勢：可以同時進行多片段的重組克隆，而這對于傳統(tǒng)酶切-酶連克隆是一個很大的挑戰(zhàn)软驰〗е希基于傳統(tǒng)克隆技術(shù)可能需要克隆一個片段后，再在特定位置選擇酶切位點锭亏，插入第二個片段纠吴，依次推進，這樣不僅實驗周期長慧瘤，并且會在每個片段之間引入了額外的酶切位點堿基序列戴已，可能影響到基因的完整性固该。不過可以通過融合PCR的方式，設(shè)計末端重疊的引物進行各個克隆片段的融合糖儡，但長的基因片段的PCR擴增本身也存在著失敗率提高的問題（表8）伐坏。

表8.無縫克隆與傳統(tǒng)克隆的比較

總結(jié)

????????本部分我們主要介紹了基因克隆中使用的工具酶和載體，并以PVT1的克隆和表達載體的構(gòu)建為例握联，分別介紹了T/A克隆桦沉、傳統(tǒng)酶切-酶連克隆和無縫克隆技術(shù)的實驗流程。

參考文獻

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