轉(zhuǎn)發(fā)自http://crickcollege.com/news/169.html

一辉川、蛋白定性檢測(cè)（續(xù)）

上一篇我們聊了基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)研究背景，以及定性檢測(cè)的一部分厂财，今天我們繼續(xù)分享課程里定性檢測(cè)的數(shù)據(jù)庫(kù)搜庫(kù)新症、結(jié)果評(píng)估筑凫，以及定量檢測(cè)和靶向蛋白質(zhì)組學(xué)的內(nèi)容嫌变。

搜庫(kù)工具

說(shuō)到搜庫(kù)吨艇，對(duì)用我們使用者來(lái)說(shuō)，其實(shí)并不復(fù)雜腾啥，只需要搞清楚以下五個(gè)要素东涡，搜庫(kù)就妥妥的了！

1） 蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)：通常是FASTA格式倘待，從公共數(shù)據(jù)庫(kù)下載软啼，如果是未知的蛋白，可以從DNA測(cè)序的序列翻譯成蛋白延柠；最常用的數(shù)據(jù)庫(kù)Uniprot。

2） 特異性酶解：在搜庫(kù)時(shí)要明確使用的蛋白酶是哪一種锣披，比如最常用的胰蛋白酶（軟件會(huì)自動(dòng)識(shí)別它在K或R后面切斷肽段）贞间。如果我們不對(duì)酶切位點(diǎn)進(jìn)行限制，計(jì)算機(jī)只好把所有的可能都窮盡一遍雹仿，產(chǎn)生非常多可能的肽段增热，不僅運(yùn)行時(shí)間會(huì)非常長(zhǎng)，而且錯(cuò)誤匹配的可能性也會(huì)高很多胧辽。

3） 轉(zhuǎn)錄后修飾：分兩類峻仇，一種叫固定修飾，即在某種氨基酸殘基上一定出現(xiàn)的特定基團(tuán)修飾邑商，比如加入乙跎闩兀化試劑進(jìn)行乙酰化修飾人断；另一種叫可變修飾（動(dòng)態(tài)修飾）吭从，就是說(shuō)某一種氨基酸殘基可能會(huì)被某種基因修飾（被修飾的可能性比較大），例如甲硫氨酸的氧化等恶迈。

4） 碎片類型：上一篇專門講過(guò)涩金，比如CID或HCD碎裂產(chǎn)生by離子，搜索引擎就只按by離子的規(guī)則切割；沒(méi)特別的原因步做，不建議大家再加入其它離子類型副渴，不然會(huì)大大延長(zhǎng)搜庫(kù)時(shí)間，還會(huì)引入錯(cuò)誤全度；如果是ETD碎裂則會(huì)產(chǎn)生cz離子煮剧，而QTOF會(huì)產(chǎn)生ax離子。搜庫(kù)軟件通常會(huì)根據(jù)我們指定的儀器類型來(lái)自動(dòng)判斷碎片離子的類型讼载。

5） 選擇合適的搜庫(kù)軟件：接下來(lái)詳聊轿秧。

首先出場(chǎng)的是世界上第一款搜庫(kù)軟件SEQUEST！雖然幾經(jīng)升級(jí)更新咨堤，它仍然保留了最初設(shè)計(jì)時(shí)的基本架構(gòu)菇篡，并且仍然被廣泛使用。SEQUEST的思路主要分兩步走：先對(duì)匹配結(jié)果給出一個(gè)預(yù)打分一喘，然后再通過(guò)全局的評(píng)估打出最后得分驱还。目前整合了SEQUEST搜庫(kù)方法的軟件還有Proteome Discovery、X!Tandem凸克、Comet等议蟆。

第二款軟件是被認(rèn)為是目前世界上使用最為廣泛的搜庫(kù)工具M(jìn)ascot，由英國(guó)Matrix Science公司研發(fā)(www.matrixscience.com萎战，國(guó)內(nèi)的代理商為康昱盛公司)咐容。它與SEQUEST的搜庫(kù)算法完全不同，是基于概率的打分蚂维。它之所以廣愛歡迎戳粒，主要有以下幾個(gè)特點(diǎn)：

1） 能給出清楚明了的搜庫(kù)結(jié)果報(bào)告；

2） 對(duì)蛋白的鑒定率很高虫啥；

3） 可以整合和分析幾乎所有主流的質(zhì)譜儀器原始數(shù)據(jù)蔚约；

4） 搜索速度很快。

還有一款開源軟件也值得介紹給大家：X!Tandem涂籽。它的打分算法其實(shí)與SEQUEST是一樣一樣的苹祟，但搜庫(kù)速度相當(dāng)快，近年來(lái)用戶數(shù)增長(zhǎng)很顯著评雌，感興趣的小伙伴們可以訪問(wèn)以下網(wǎng)站獲取更多的信息：www.thegpm.org

除了以上三種搜庫(kù)軟件树枫，目前我們能看到的類似的工具還有很多很多，比如Comet, OMSSA, InsPecT, MyriMatch, Phenyx, SpectrumMill, ProteinPilot等等景东。其實(shí)這些軟件的處理步驟都是搜庫(kù)和打分团赏，但它們所使用的算法思路又各不相同。推薦給大伙兒的做法是耐薯，選擇兩個(gè)基于不同算法的搜庫(kù)軟件舔清，分別進(jìn)行打分丝里，然后將結(jié)果合并，可以得到比單用一種搜庫(kù)算法高一些的鑒定結(jié)果体谒。

搜庫(kù)流程

說(shuō)到底杯聚，搜庫(kù)軟件在報(bào)告最終的匹配結(jié)果之前，到底都做了些什么操作呢抒痒？

首先幌绍，把質(zhì)譜儀得到的譜圖輸入搜庫(kù)軟件。對(duì)于搜庫(kù)軟件來(lái)說(shuō)故响，碎片離子的信息越豐富越好傀广。如果最后給出的搜庫(kù)結(jié)果不好，建議大伙兒點(diǎn)開二級(jí)譜圖檢查一下彩届，是否因?yàn)樗槠畔⑻俣斐傻奈北蛘呤且驗(yàn)槎?jí)碎片的intensity太低。

大伙兒要記得樟蠕，二級(jí)碎片的信息主要是用來(lái)做蛋白序列信息推導(dǎo)的贮聂，如果二級(jí)譜圖給我們的信息太少，就很難做出一個(gè)好的鑒定結(jié)果寨辩。二級(jí)譜圖質(zhì)量不高有各種可能的原因吓懈，比如樣品本身的原因，或者質(zhì)譜儀的原因靡狞，這個(gè)要根據(jù)實(shí)際情況來(lái)逐一排查耻警。

（對(duì)于我們這些小白來(lái)說(shuō)，如果你拿到搜庫(kù)軟件只會(huì)點(diǎn)點(diǎn)鼠標(biāo)甸怕，那就是入門一級(jí)的水平榕栏，如果你還會(huì)打開二級(jí)譜圖查看一番，那就升到二級(jí)了_這也是為啥雖然并不需要自己寫搜庫(kù)軟件蕾各，咱們還是要學(xué)習(xí)一下搜庫(kù)原理。）

除了譜圖庆揪，還將讀入母離子及電荷狀態(tài)等信息式曲，這些都存儲(chǔ)于RAW文件中，所以我們只需要輸入RAW文件缸榛，并指定之前談到的五個(gè)變量吝羞，就可以開始搜庫(kù)了。

搜庫(kù)軟件通過(guò)以下五步來(lái)實(shí)現(xiàn)譜圖的正確匹配：

1） 從數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇分子量與輸入值相等的肽段内颗；

2） 生成理論碎片钧排，并生成理論譜圖；

3） 將實(shí)驗(yàn)譜圖與理論譜圖進(jìn)行匹配均澳；

4） 對(duì)匹配進(jìn)行打分恨溜；

5） 將打分進(jìn)行排序符衔，通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，確定最佳的匹配結(jié)果并導(dǎo)出糟袁。

來(lái)判族，我們看一張形象點(diǎn)的圖，再來(lái)理解一下這五步到底是怎么實(shí)現(xiàn)的项戴。

假設(shè)我們的譜圖檢測(cè)到的是一條1000分子量的肽段形帮，則搜庫(kù)軟件首先會(huì)在蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)里對(duì)所有可能的蛋白序列進(jìn)行特定位點(diǎn)的酶切（酶切位點(diǎn)由我們指定的特異性酶參數(shù)來(lái)決定），然后選出分子量1000左右的肽段周叮，根據(jù)指定的儀器類型辩撑，模擬打碎成理論上的碎片離子，然后生成理論譜圖仿耽，再與輸入的實(shí)際譜圖進(jìn)行比對(duì)合冀，得到一個(gè)相似性打分，按得分高低進(jìn)行排序氓仲，最后挑選出匹配結(jié)果水慨。

鑒定結(jié)果評(píng)估

聽上去整個(gè)過(guò)程并不復(fù)雜，對(duì)不對(duì)敬扛？事實(shí)上晰洒，由于各種因素對(duì)搜庫(kù)匹配的影響，這里面最重要的問(wèn)題是啥箭，怎么判斷哪些鑒定結(jié)果是對(duì)的谍珊！也就是說(shuō)，我們需要對(duì)匹配結(jié)果進(jìn)行評(píng)估急侥。

在過(guò)去砌滞，評(píng)估的大部分工作需要手工完成。下面這個(gè)餅圖大伙兒感受一下：整個(gè)樣品制備+質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)+數(shù)據(jù)庫(kù)搜索只占了25%的時(shí)間坏怪，而對(duì)結(jié)果的手工驗(yàn)證要花掉75%的時(shí)間贝润！是不是很可怕！

還好铝宵，我們已經(jīng)不用再受這種折磨了打掘，如今的各種搜庫(kù)軟件都自帶統(tǒng)計(jì)學(xué)算法來(lái)幫我們進(jìn)行評(píng)估，幸福感頓時(shí)提升了好幾個(gè)數(shù)量級(jí)鹏秋！

目前主流的統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)估算法有兩種思路：

1） target-decoy 也就是通常所說(shuō)的正庫(kù)反庫(kù)策略

2） peptideprophet 基于概率的打分

感興趣的童鞋可以翻看我們之前的推文尊蚁，專門對(duì)蛋白鑒定的統(tǒng)計(jì)學(xué)指標(biāo)進(jìn)行詳細(xì)的介紹：

二、蛋白定量檢測(cè)

為什么要做定量侣夷，這個(gè)大概不用小編多啰嗦了吧横朋？總之，定量檢測(cè)可以研究不同生理狀態(tài)及不同時(shí)間點(diǎn)上各種蛋白表達(dá)量的變化百拓，研究意義是大大的有扒俣А晰甚！

在質(zhì)譜史前時(shí)代，是2D膠的天下祠够。前面也提過(guò)压汪，2D膠的通量、準(zhǔn)確性以及可重復(fù)性都沒(méi)法跟質(zhì)譜比古瓤。

說(shuō)到利用質(zhì)譜對(duì)蛋白進(jìn)行定量檢測(cè)止剖，可以分為基于MS1（一級(jí)譜圖）的定量，以及基于MS2的定量落君。啥意思呢穿香？基于MS1的定量是指根據(jù)一級(jí)譜圖的信息得到定量結(jié)果，同理绎速，基于MS2的定量是指根據(jù)二級(jí)譜圖的信息得到定量結(jié)果皮获。

基于MS1的定量

基于MS1的定量方法最早是ICAT（ICAT是標(biāo)記試劑的名字，這種定量方法現(xiàn)在用得很少了）纹冤，現(xiàn)在常用的SILAC洒宝，以及l(fā)abel free非標(biāo)記定量。我們來(lái)說(shuō)說(shuō)SILAC定量策略萌京。

SILAC（Stable Isotope Labeling Strategies）翻譯過(guò)來(lái)就是穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)雁歌，說(shuō)得簡(jiǎn)單一點(diǎn)，就是想辦法把非天然同位素?fù)降诫亩卫锎嫣烊煌凰刂校缓笥?jì)算譜圖里各個(gè)同位素的峰面積靠瞎，其差值就對(duì)應(yīng)著蛋白相對(duì)量的變化。

通常呢求妹，我們是利用C13或者N15這類穩(wěn)定的同位素（叫做重標(biāo)）乏盐，用培養(yǎng)基或者飼料對(duì)細(xì)胞或者實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行培養(yǎng)或喂食。大伙兒應(yīng)該知道吧制恍，有一類氨基酸叫必需氨基酸父能，比如Lys和Arg，是生物體自身無(wú)法合成的净神，需要從外界攝入何吝。于是，從外界攝入的過(guò)程中强挫，Lys和Arg里包含的C12或N14，就被C13或N15取代了薛躬。

妙的是俯渤，Lys和Arg又正好是胰蛋白酶的酶切位點(diǎn)，所以它又能保證每條切出來(lái)的肽段至少有一個(gè)Lys或Arg型宝，也就是說(shuō)八匠，每條肽段上至少有一個(gè)殘基是有同位素標(biāo)記的絮爷，完美！

SILAC的標(biāo)記效率很高梨树，比如細(xì)胞培養(yǎng)坑夯，通常5、6代以后抡四，同位素標(biāo)記就有95%左右的比例了柜蜈。重標(biāo)標(biāo)記好后，將沒(méi)有同位素標(biāo)記的樣品（通常叫輕標(biāo)）與重標(biāo)的樣品1：1混合指巡，經(jīng)過(guò)分離淑履、酶切等步驟，進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)藻雪。得到的譜圖會(huì)有對(duì)應(yīng)的兩個(gè)峰秘噪，峰面積的差值就是不同樣品中相應(yīng)蛋白的相對(duì)量的變化了。

所以勉耀，SILAC定量是一種相對(duì)定量方法指煎，我們只能得到兩組樣品之間每種蛋白含量的差異值，而無(wú)法知道它們的絕對(duì)量便斥。

如果你有三組樣本想要進(jìn)行SILAC定量至壤，我們可以把C13和N15標(biāo)記組合一下，比如輕標(biāo)（不標(biāo)記）椭住、中標(biāo)（C13標(biāo)記）和重標(biāo)（C13和N15共同標(biāo)記）崇渗，然后三組樣品1：1：1混合。

怎么把同位素標(biāo)記上去這件事情京郑，方法有很多宅广，可以分為代謝同位素標(biāo)記，化學(xué)方法標(biāo)記些举，酶反應(yīng)標(biāo)記跟狱。比如我們剛才舉例的細(xì)胞培養(yǎng)，就屬于代謝同位素標(biāo)記户魏，這也是其中最常用的方法驶臊；通過(guò)化學(xué)反應(yīng)在特別的肽段上加一個(gè)基團(tuán)這種方法叫做化學(xué)方法標(biāo)記；酶切的時(shí)候在斷裂位點(diǎn)標(biāo)記這種方法在酶反應(yīng)標(biāo)記（通常使用O18同位素）

剛才小編在講到SILAC定量時(shí)叼丑，云淡風(fēng)輕地提到峰面積关翎。有沒(méi)有童鞋對(duì)“峰面積”到底是什么心存疑惑呢？小編用一張圖告訴你：

上圖是在時(shí)間軸上從一級(jí)質(zhì)譜得到的多張譜圖鸠信，在荷質(zhì)比軸上的每一根小柱子代表的是肽段在不同時(shí)間點(diǎn)上被檢測(cè)到的值纵寝，我們用黃色小柱子表示其中一種肽段，將這四個(gè)黃色小柱子的頂點(diǎn)連起來(lái)星立，就可以畫出一個(gè)峰型爽茴，這個(gè)峰的面積就是肽段的量（通過(guò)若干肽段的量我們可以推出蛋白質(zhì)的量）葬凳。

對(duì)這個(gè)圖，小編的理解是室奏，假設(shè)質(zhì)譜掃描的速度是無(wú)限地快火焰，相當(dāng)于可以把一個(gè)時(shí)間段分為無(wú)數(shù)個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)上都能掃描得到一個(gè)值（小柱子）胧沫，然后在時(shí)間軸上把這些值全部加起來(lái)（做積分）于是就得到了這個(gè)肽段的量昌简。

基于MS2的定量

扯完了基于MS1的定量，我們繼續(xù)扯基于MS2的定量琳袄，也就是基于報(bào)告離子的定量江场。在Shotgun領(lǐng)域主流的方法是iTRAQ和TMT，不要被這些名字嚇到窖逗，其實(shí)就是兩種試劑的名字址否，而且原理和操作方法都差不多。以iTRAQ為例碎紊，先來(lái)一張清新的示意圖洗洗眼：

圖的左側(cè)就是iTRAQ試劑的分子式佑附，如果你覺(jué)得太小了看得不爽，那小編再來(lái)貢獻(xiàn)一張更大更簡(jiǎn)明的：

大伙兒看懂了嗎仗考？iTRAQ試劑分三個(gè)部分：報(bào)告離子（就是最終要進(jìn)入二級(jí)質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)的）音同、平衡離子（連接報(bào)告離子與反應(yīng)離子），以及與肽段反應(yīng)的反應(yīng)基團(tuán)秃嗜。

說(shuō)起來(lái)权均，這個(gè)iTRAQ試劑也是很妙的，它這三個(gè)基團(tuán)里含有一堆同位素锅锨，每種同位素的總量是一個(gè)固定的值叽赊，但具體位置可以變化，主要體現(xiàn)在報(bào)告離子上的變化必搞，于是我們可以得到幾種不同的報(bào)告離子必指。

說(shuō)得詳細(xì)點(diǎn)兒，假設(shè)（只是假設(shè)哈）恕洲，我們同時(shí)用了四個(gè)C13塔橡，四個(gè)N15來(lái)標(biāo)記整個(gè)iTRAQ分子，無(wú)論這四個(gè)C13和四個(gè)N15的位置有多么不同霜第，大家總的分子量都是一樣的葛家。但對(duì)于報(bào)告離子來(lái)說(shuō)，可以有變化泌类，比如第一個(gè)報(bào)告離子被標(biāo)記了一個(gè)C13癞谒，第二個(gè)報(bào)告離子被標(biāo)記了一個(gè)N15，第三個(gè)標(biāo)記了C13+N15，第四個(gè)標(biāo)注記C13+C13+N15.

由于可以做這樣的位置組合扯俱，我們常聽到的iTRAQ“四”標(biāo)或者“八”標(biāo)，就是指標(biāo)記位置的不同組合的數(shù)量喇澡。以四標(biāo)為例迅栅，在MS1時(shí)就通過(guò)iTRAQ試劑中的反應(yīng)基團(tuán)將整個(gè)iTRAQ試劑標(biāo)記在肽段上，這里面包含了四種同位素標(biāo)記的組合晴玖，但由于它們總的分子量都相同读存，對(duì)樣品不會(huì)產(chǎn)生什么影響。

好呕屎，接下來(lái)我們將標(biāo)記好的樣品送入二級(jí)質(zhì)譜让簿，經(jīng)過(guò)與惰性氣體的碰撞碎裂，iTRAQ試劑會(huì)按它固定的方式將報(bào)告離子碎裂出來(lái)秀睛，于是尔当，四種標(biāo)記位置不同的iTRAQ試劑碎裂后，得到四種分子量不同的報(bào)告離子蹂安！將這四種報(bào)告離子混合以后得到譜圖椭迎，根據(jù)譜峰面積可以推導(dǎo)它們各自標(biāo)記的肽段的量。是不是很機(jī)智的一種方法田盈？

我們還是以四標(biāo)為例畜号，報(bào)告離子的荷質(zhì)比分別是114，115允瞧，116简软，117，于是述暂，在二級(jí)譜圖的110-120的范圍里痹升，我們會(huì)看到一個(gè)與by離子完全不同的非常高的峰，就像這樣：

這就是iTRAQ方法標(biāo)志性的峰贸典！把這個(gè)峰放大视卢，我們就能清楚地看到四個(gè)峰，就是對(duì)應(yīng)的四個(gè)通道廊驼。像下面這樣：

Tips：用iTRAQ方法定量的時(shí)候据过，質(zhì)譜儀的參數(shù)需要根據(jù)試劑碎裂時(shí)的碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化，就是說(shuō)妒挎，要將報(bào)告離子充分地碎裂出來(lái)绳锅，才能保證它可以被穩(wěn)定可靠地檢測(cè)。

大伙兒如果能基本理解iTRAQ四標(biāo)的原理酝掩，對(duì)于iTRAQ八標(biāo)鳞芙，TMT六標(biāo)或者十標(biāo)，都可以類推了。只需要注意的是原朝，iTRAQ與TMT試劑來(lái)不同的質(zhì)譜儀公司驯嘱，因此對(duì)質(zhì)譜儀也有選擇性的，大家在選擇到底用哪種標(biāo)記試劑的時(shí)候喳坠，除了要考慮標(biāo)記的樣本數(shù)鞠评，也要考慮對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜儀品牌和類型了。

三壕鹉、靶向蛋白質(zhì)組學(xué)

前面我們聊過(guò)了蛋白質(zhì)組學(xué)的定性檢測(cè)與定量檢測(cè)剃幌，接下來(lái)我們整點(diǎn)兒更前沿的，代表著未來(lái)一個(gè)重要發(fā)展方向的東西：靶向蛋白質(zhì)組學(xué)晾浴！

話說(shuō)负乡，在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)如火如荼的今天，最能代表有機(jī)體當(dāng)下生命狀態(tài)的蛋白質(zhì)組學(xué)脊凰，如何大規(guī)模地應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域呢抖棘？與基因組學(xué)相比，蛋白質(zhì)組學(xué)目前的瓶頸到底在什么地方呢狸涌？

簡(jiǎn)單說(shuō)來(lái)钉答，蛋白質(zhì)組學(xué)的著力點(diǎn)一直是研發(fā)更高通量的技術(shù)平臺(tái)，發(fā)現(xiàn)更多未知的蛋白杈抢。當(dāng)我們轉(zhuǎn)身關(guān)注生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域時(shí)才發(fā)現(xiàn)数尿，人家并不需要一次檢測(cè)上萬(wàn)個(gè)蛋白這么高的通量，但是卻需要在大量的樣本中惶楼，高度穩(wěn)定地重復(fù)地檢測(cè)幾十個(gè)幾百個(gè)蛋白右蹦。

比如說(shuō)，當(dāng)我們?cè)噲D把蛋白質(zhì)組學(xué)研究手段用于臨床生物標(biāo)志物的研發(fā)時(shí)歼捐，走到第二步就卡住了何陆！要在上百個(gè)樣本中重復(fù)檢測(cè)一些候選標(biāo)志物蛋白質(zhì)，真的很困難氨ⅰ贷盲！

這種困難是什么造成的呢？最重要的原因是剥扣，也就是 Shotgun方法的局限性巩剖，它只適合檢測(cè)高豐度蛋白，含量不夠高的蛋白很容易漏檢钠怯，而這些卻往往是真正可能的生物標(biāo)志物佳魔。此處請(qǐng)大家腦補(bǔ)一下小編介紹DDA（數(shù)據(jù)依賴性采集）時(shí)提到的，低豐度蛋白進(jìn)入二級(jí)質(zhì)譜的機(jī)會(huì)都很少晦炊！對(duì)于低豐度蛋白鞠鲜，可能出現(xiàn)的結(jié)果就是宁脊，一會(huì)兒檢測(cè)到了，一會(huì)兒又檢測(cè)不到…這叫人怎么忍贤姆？

以血液中包含的蛋白為例榆苞，大家感受一下，紅色的都是非候選標(biāo)志物霞捡，但含量都非常高语稠。余下的低豐度蛋白我們又搞不定。這么看來(lái)弄砍，對(duì)于臨床應(yīng)用，蛋白質(zhì)組學(xué)還有希望嗎输涕？

2012年音婶，一種新的方法被nature method選為年度新方法，認(rèn)為是未來(lái)發(fā)展的大趨勢(shì)莱坎，它的名字就叫靶向蛋白質(zhì)組學(xué)衣式！于是，希望來(lái)了~

靶向蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)到底是怎樣的不同檐什？它大體上可以分為幾類：MRM/SRM碴卧、PRM、SWATH/DIA乃正。大伙兒就跟著小編來(lái)了解一下其中兩種比較有代表性的吧~

MRM/SRM

先來(lái)名詞解釋一下：

SRM：Selective Reaction Monitor（選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)）住册，就是先只選擇一個(gè)肽段離子，碰撞后瓮具，從形成的碎片離子中也只選一個(gè)離子荧飞，進(jìn)行檢測(cè)。因?yàn)閮刹蕉贾贿x單離子名党，針對(duì)性很強(qiáng)叹阔，可以排除噪音和干擾的影響。

MRM：Multi Reaction Monitor（多反應(yīng)監(jiān)測(cè)）就是多個(gè)化合物同時(shí)測(cè)定時(shí)传睹，多個(gè)SRM一起做耳幢。不需要特意區(qū)分SRM和MRM，只要一次實(shí)驗(yàn)是同時(shí)做幾個(gè)SRM欧啤，就是MRM方式了睛藻。

概括來(lái)說(shuō)，由于MRM/SRM預(yù)先選定了需要分析的肽段及碎片離子邢隧，而不像之前的方法修档，眉毛胡子一把抓，這樣可以繞過(guò)一級(jí)質(zhì)譜中只能選擇高峰度Tops的標(biāo)準(zhǔn)府框，從而保證低峰度蛋白可以不受影響吱窝。

第一篇MRM/SRM應(yīng)用的文獻(xiàn)于2009年發(fā)表在CELL上的讥邻，對(duì)酵母全蛋白組做了精確定量，覆蓋了從1E6 copies/cell 到100 copies/cell的蛋白院峡，無(wú)一遺漏兴使，是不是很贊！（Cell 138, 795-806, Auguest21, 2009）

另一個(gè)激動(dòng)人心的應(yīng)用發(fā)表于2013年照激，利用MRM/SRM技術(shù)成功研發(fā)出肺癌篩選的試劑盒发魄，從371個(gè)候選蛋白中選出13個(gè)蛋白的panel作為檢測(cè)目標(biāo)。該試劑盒已得到美國(guó)FDA批準(zhǔn)俩垃，在美國(guó)上市使用励幼，進(jìn)入醫(yī)保支付范圍。感興趣的小伙伴們可以找文獻(xiàn)來(lái)研讀一下（Sci Transl Med 5, 207ra142, 2013）.

還有一種與MRM/SRM很類似的方法口柳，叫PRM苹粟。它唯一的不同是，MRM/SRM的母離子和子離子都需要預(yù)先選定跃闹，而PRM只需要選定母離子嵌削，而不需要預(yù)選子離子。這是因?yàn)镻RM是在高精度的Orbitrap質(zhì)譜儀上做（MRM/SRM是在三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀上做）望艺，由于精度夠高苛秕，可以對(duì)多種子離子同時(shí)進(jìn)行準(zhǔn)確的測(cè)定。由于不需要選定子離子找默，PRM方法實(shí)施起來(lái)更容易艇劫，而MRM/SRM則需要針對(duì)子離子不斷優(yōu)化儀器參數(shù)。

DIA

MRM之類的技術(shù)惩激，需要預(yù)先選定多肽及肽段離子港准，那么問(wèn)題就來(lái)了，如果我們想發(fā)現(xiàn)點(diǎn)新的東西呢咧欣？我沒(méi)法預(yù)先選定扒掣住！

這種情況下魄咕，你需要關(guān)注的就是第二種代表性的靶向蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)DIA（data-independent acquisition）了衩椒，也就是“數(shù)據(jù)非依賴性采集”策略。

DIA的一個(gè)代表性方法叫SWATH技術(shù)（由蛋白質(zhì)組學(xué)泰山北斗Ruedi教授所在的蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院與AB SCIENX公司合作將這個(gè)方法商業(yè)化）哮兰。它的基本思路是：選擇母離子的質(zhì)荷比m/z在500-900或400-1000左右的范圍內(nèi)毛萌，每25Dal作為一個(gè)窗口，比如喝滞，先分離500-525這個(gè)范圍的肽段阁将，然后碎片化，接下來(lái)采集525-550分子量范圍的肽段右遭，依次類推做盅。

DIA的一級(jí)質(zhì)譜可以很均勻地采集每個(gè)范圍窗口的肽段缤削，不會(huì)有遺漏，不涉及到對(duì)母離子的限制性篩選吹榴，所以無(wú)論是準(zhǔn)確性還是可重復(fù)性亭敢，與DDA相比都得到了很好的提升，前途一片大好图筹！

不過(guò)呢帅刀，細(xì)心一點(diǎn)的童鞋就會(huì)發(fā)現(xiàn)，DIA一次采集的范圍有25DAL远剩，顯然是很寬的了扣溺！這就意味著，每一次放進(jìn)來(lái)的肽段會(huì)很多瓜晤，產(chǎn)生的碎片離子也非常復(fù)雜锥余，于是我們會(huì)拿到非常復(fù)雜的譜圖。

如果用以往的搜庫(kù)方法活鹰，拿理論譜圖去匹配這么復(fù)雜的真實(shí)譜圖，很容易漏掉很多信息只估，準(zhǔn)確率沒(méi)法保證志群。怎么辦呢？DIA的策略是蛔钙，先收集真實(shí)的譜圖庫(kù)锌云，然后拿實(shí)驗(yàn)譜圖與真實(shí)譜圖庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，來(lái)鑒定肽段吁脱。

當(dāng)然啦桑涎，即便如此，DIA復(fù)雜的譜圖仍然給后續(xù)的數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)帶來(lái)很多挑戰(zhàn)兼贡，也激起了各種大神的興趣攻冷！在這一兩年的各種蛋白質(zhì)組學(xué)會(huì)議上，如果大伙兒留意的話遍希，會(huì)發(fā)現(xiàn)對(duì)DIA數(shù)據(jù)分析的技術(shù)討論是相當(dāng)?shù)幕馃岬嚷∥覀円财诖鳧IA領(lǐng)域的突破和發(fā)展！