天然次級(jí)代謝產(chǎn)物是重要的藥物來(lái)源殊霞，非核糖體肽（non-ribosomal peptide,NRP）是自然界中廣泛存在的次級(jí)代謝產(chǎn)物，其多樣的化學(xué)結(jié)構(gòu)使其具有多種生物活性涤躲，如抗炎捎琐、抗腫瘤、抗病毒等否彩。基于非核糖體多肽合成酶（nonribosomal peptide synthetases,NRPS）模塊化線性合成多肽的原理對(duì)其催化模塊進(jìn)行改造嗦随、重組列荔，定向設(shè)計(jì)多肽的生物合成途徑以獲得目的多肽已成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。然而雜合 NRPS存在催化模塊無(wú)法加載目標(biāo)氨基酸或多肽合成效率顯著降低等諸多問(wèn)題枚尼，限制了其應(yīng)用贴浙。近年來(lái)，NRPS腺苷跏鸹校化域（adenylation domain崎溃，A域）及縮合結(jié)構(gòu)域（condensation domain，Ｃ域）的底物選擇性盯质、NRPS亞基間對(duì)接域（docking domain袁串，DD）和模塊間連接區(qū)（linker）的研究已取得較大突破。從 Ｃ域?qū)Φ孜锏倪x擇性及以不同融合邊界進(jìn)行催化單元替換兩方面進(jìn)行綜述呼巷，介紹NRPS催化模塊重構(gòu)的研究進(jìn)展囱修，并概述了各替換方案的優(yōu)點(diǎn)與局限性。

關(guān)鍵詞 非核糖體肽合成酶 結(jié)構(gòu)域雜合 腺苷醵涫牛化域 縮合結(jié)構(gòu)域

在過(guò)去的幾十年里蔚袍，次級(jí)代謝產(chǎn)物是重要的藥物來(lái)源。由非核糖體肽合成酶催化合成的非核糖體肽家族是次級(jí)代謝產(chǎn)物中的一類重要化合物配名，因其豐富多樣的化學(xué)結(jié)構(gòu)和用途成為可供挖掘的藥庫(kù)，如具有抗菌活性的達(dá)托霉素晋辆、多黏菌素渠脉、萬(wàn)古霉素，具有抗炎和免疫抑制作用的環(huán)孢霉素?Ａ瓶佳，具有抗腫瘤活性的博來(lái)霉素(圖1)芋膘。

非核糖體肽生物合成機(jī)制有別于傳統(tǒng)的依賴核糖體合成的蛋白質(zhì)或多肽。其主要是通過(guò)一個(gè)巨大的非核糖體肽合成酶將氨基酸線性組裝起來(lái)霸饲。非核糖體肽合成酶是由多個(gè)模塊組成的復(fù)合酶酶系为朋，每個(gè)模塊負(fù)責(zé)一輪肽鍵的延伸，并且模塊與氨基酸的組裝順序存在一一對(duì)應(yīng)關(guān)系厚脉。其中模塊化催化單元最基本的功能域包括縮合域习寸、腺苷酰化域傻工、肽基載體蛋白結(jié)構(gòu)域（thiolation domain,Ｔ域）霞溪。非核糖體肽合成酶線性催化合成多肽的基本過(guò)程如下：(1)Ａ域從氨基酸底物池中特異性識(shí)別激活氨基酸并將氨基酸腺苷醴踔停化形成氨酰-AMP，隨后氨酰-AMP共價(jià)結(jié)合到經(jīng)磷酸泛酰 巰 基 乙 胺 基 轉(zhuǎn) 移 酶(phosphopantetheinetransferase,PPTase) 活化的?Ｔ域上鸯匹，形成氨酰硫脂坊饶；(2)Ｔ域?qū)滨Ａ蛑D(zhuǎn)移到?Ｃ域，在?Ｃ域該氨酰硫脂的游離氨基親核進(jìn)攻上一個(gè)中間體的羰基殴蓬，使其硫酯鍵斷裂而形成肽鍵匿级，由此完成一輪底物縮合；(3)第二步形成的肽鏈中間體轉(zhuǎn)移至同一模塊的?Ｔ域染厅，作為下一模塊的供體肽鏈根蟹；(4)在硫酯酶結(jié)構(gòu)域(thioesterase domain,TE域)的水解或環(huán)化作用下多肽釋放(圖2)。此外糟秘，一些模塊中還含有差向異構(gòu)域简逮、氧化域、甲基化域等尿赚，增加了非核糖體肽的結(jié)構(gòu)多樣性散庶。除?20種蛋白質(zhì)源氨基酸外，非核糖體肽結(jié)構(gòu)中還可摻入?Ｄ-氨基酸凌净、Ｎ-甲 基 化 氨 基 酸悲龟、β-氨 基 酸、α-羥 基 酸冰寻、羧 酸须教、胺等。

基于NRPS線性合成機(jī)制和模塊化原理斩芭，人們一直嘗試采用組合生物合成的方法對(duì)編碼非核糖體肽合成酶的催化單元進(jìn)行操作］轻腺，以亞基交換-或模塊/結(jié)構(gòu)域交換/增加/減少等方式改變?cè)蟹呛颂求w肽的生物合成途徑，獲得新的非核糖體肽類化合物或其衍生物划乖。但是前期的研究數(shù)據(jù)表明隨機(jī)尋找NRPS結(jié)構(gòu)域邊界間的蛋白質(zhì)同源區(qū)域進(jìn)行模塊交換的成功率并不高：一方面贬养，按一般規(guī)律進(jìn)行模塊交換和雜合，往往導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量的急劇下降琴庵；另一方面误算，合適的交換邊界僅在蛋白質(zhì)序列同源性較高的 NRPS之間較易尋找，具有一定局限性迷殿。近年來(lái)儿礼，NRPS催化模塊重構(gòu)研究取得了較大的突破，我們?cè)谙挛闹袑?duì)相關(guān)進(jìn)展進(jìn)行了重點(diǎn)論述庆寺。

１ 模塊替換

對(duì)NRPS進(jìn)行改造主要有兩個(gè)難點(diǎn)：其一是酶對(duì)底物變化的容忍度蚊夫；其二是在功能域之間重組拼裝過(guò)程中，融合邊界對(duì)蛋白質(zhì)整體結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響從而降低了酶活止邮。因此要使雜合NRPS可識(shí)別加載底物合成目的多肽及提高雜合NRPS的催化效率这橙，關(guān)鍵在于提高雜合模塊對(duì)底物的選擇性以及將嵌入蛋白對(duì)整體蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的影響減至最小奏窑。我們認(rèn)為至少需要考慮三方面的問(wèn)題：一是雜合模塊來(lái)源的選擇。對(duì)應(yīng)同一氨基酸殘基融合不同NRPS來(lái)源的功能模塊催化效率是否有差異屈扎。二是雜合邊界的選擇埃唯。可以根據(jù)蛋白質(zhì)序列的保守性判斷每一個(gè)結(jié)構(gòu)域的邊界鹰晨，通過(guò)原始模塊與替換模塊間蛋白質(zhì)序列的比對(duì)在結(jié)構(gòu)域連接區(qū)域?qū)ふ彝葱暂^高的序列作為邊界節(jié)點(diǎn)進(jìn)行替換墨叛。三是考慮縮合域的底物特異性。雖然腺苷跄＠化A域是底物氨基酸選擇的第一道門檻漠趁，但是催化模塊中的縮合結(jié)構(gòu)域C域?qū)Φ孜镆灿羞x擇特異性。往往在對(duì)NRPS的A結(jié)構(gòu)進(jìn)行替換后忍疾，腺苷醮炒基化的氨基酸不能在C域進(jìn)行縮合反應(yīng)而使肽鏈無(wú)法延伸，且C域?qū)ζ湎噜徬掠危劣虻牡孜镞x擇性產(chǎn)生影響卤妒。

1.1腺苷跎蹋化域替換

在非核糖體肽裝配過(guò)程中，首先由腺苷踉蚺化域從可利用的氨基酸底物池中選擇相對(duì)應(yīng)的特異氨基酸合成相應(yīng)的氨酰-AMP共缕。許多研究表明，NRPS每一催化模塊延伸氨基酸的特異性主要取決于A域和C域士复，其中A域是底物氨基酸選擇的第一道門檻图谷。A域腺苷酰化氨基酸底物的特異性導(dǎo)致催化模塊延伸氨基酸殘基的 差 異阱洪。因 此便贵，最 早 的 模 塊 替 換 集 中 在 A 域。Stachelhaus等,于1995年在枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)中用異源 Ａ域替換脂肽抗生素Surfactin合成酶SrfA-C中中Leu7特異性A域(SrfA-A7),成功得到了Phe7澄峰、Orn7嫉沽、Cys7、Val7取代的系列Surfactin類似物 (圖3a)俏竞。隨后,該團(tuán)隊(duì)繼續(xù)用異源AT域替換合成酶SrfA-A中Leu2特異性A域(SrfA-A2),得到了Orn2取代的Surfactin類似物[21]。雖然上述A域及AT域替換均得到了目的產(chǎn)物,但該實(shí)驗(yàn)中Surfactin類似物的產(chǎn)量均明顯下降堂竟。此外,并不是所有的A域替換均能獲得預(yù)期產(chǎn)物魂毁。例如,Ackerley和Lamont[22]分別采用異源的腺苷酰化L-Thr出嘹、Cys席楚、Val和Ser的A域替換銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa?PAO1)非核糖體肽合成酶第4個(gè)亞基PvdD模塊一的A域(L-Thr),僅腺苷酰化L-Thr的A域替換有少量產(chǎn)物pyoverdine產(chǎn)生,其余雜合的NRPS均無(wú)功能 (圖3b)税稼。此實(shí)驗(yàn)中非Thr特異性腺苷醴持龋化域替換后無(wú)多肽產(chǎn)物合成可能是由于C域的底物特異性垮斯。1999年Belshaw等,在對(duì)C域研究后提出假想,C域的C端部分為受體位點(diǎn),結(jié)合氨酰-S-PCP;N端部分為供體位點(diǎn),結(jié)合上游的肽基-S-PCP,受體位點(diǎn)對(duì)受體底物氨酰-S-PCP有強(qiáng)選擇性,供體位點(diǎn)對(duì)供體底物側(cè)鏈氨基酸僅有弱選擇性。因此雜合A域識(shí)別的Cys只祠、Val和Ser無(wú)法進(jìn)入上游C域結(jié)構(gòu),進(jìn)而無(wú)法與上游肽鏈縮合,導(dǎo)致肽鏈延伸中斷兜蠕。然而B(niǎo)elshaw等研究的不足之處在于僅以一個(gè)氨基酸即氨酰-S-PCP作供體底物,無(wú)法證明C域供體位點(diǎn)對(duì)多肽的選擇性,當(dāng)供體底物為肽-S-PCP時(shí),供體位點(diǎn)選擇性并非如此。

如前述,A域從氨基酸底物池中選擇相對(duì)應(yīng)的特異氨基酸合成相應(yīng)的氨酰-AMP抛寝。有報(bào)道顯示,A結(jié)構(gòu)域中有10個(gè)非連續(xù)編碼的關(guān)鍵氨基酸殘基決定了其底物識(shí)別的特異性熊杨。因此,除完整的A域替換外,近年來(lái)有研究嘗試替換A域內(nèi)包含關(guān)鍵活性氨基酸殘基的高度保守的一個(gè)黃素氧還蛋白樣亞域(flavodoxin-like sub domain,FSD)。交換FSD能最小地破壞A域的整體結(jié)構(gòu),維持和其它結(jié)構(gòu)域間的關(guān)鍵相互作用,使雜合的NRPS保持原有催化效率盗舰。例如,Kries等,用9個(gè)不同底物特異性的FSD替換對(duì)苯丙氨酸特異性識(shí)別的gramicidin S合成酶起始模塊GrsA的FSD晶府。其中,替換纈氨酸特異性FSD的GrsA腺苷酰化活性強(qiáng)钻趋。并且在添加脯氨酸特異性GrsB1模塊后,GrsA- GrsB1作為一個(gè)Val-Pro二酮哌嗪合成酶發(fā)揮作用,合成了D-Val-L-Pro二酮哌嗪 (圖3c)川陆。Thong等,用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù),替換enduracidin合成酶的FSD,得到了一系列新的脂肽,有的產(chǎn)量接近野生型菌株。

1.2 模塊整體替換

在NRPS中采用模塊整體替換能夠保證催化單元模塊結(jié)構(gòu)和功能的完整性蛮位。例如,用脂肽lichenysin生物合成基因簇中的Gln識(shí)別模塊CAT交換surfactin合成基因簇中的Glu模塊,得到了高產(chǎn)较沪、高活性的新型脂肽(圖4a)。用達(dá)托霉素NRPS中模塊11CASerT交換模塊8 CAAlaT,得到8號(hào)位D-Ser取代的達(dá)托霉素類似物;用模塊8 CAAlaT替換模塊11 CASerT,得到11號(hào)位D-Ala取代的達(dá)托霉素類似物土至。這兩種新化合物均對(duì)金黃色葡萄球菌具有藥理活性,但產(chǎn)量?jī)H為野生型菌株的15%和45%左右购对。有研究以T-C域間的LGG(H/D)S(I/L)保守序列為融合位點(diǎn),將一個(gè)鈣離子依賴的脂肽抗生素(calcium dependent antibiotic,CDA)合成酶模塊13 CATrpT和A54145 NRPS模塊13 CAIleT替換達(dá)托霉素NRPS模塊13CAKynT,分別獲得了13位Trp和Ile取代的達(dá)托霉素類似物,且對(duì)雜合NRPS催化效率影響較小,新化合物產(chǎn)量最高接近原產(chǎn)量的67%。

1.3 CA域替換

在1.1所述異源A域替換PvdD模塊一L-Thr A域的同時(shí), Ackerley和Lamont用異源CA域(包括L-蘇氨酸特異的CA域)替換PvdD模塊一CA域,但意外的是所有雜合酶均無(wú)活性陶因。CA域交換失敗的原因有:(1)雜合的異源CA域無(wú)法與PvdD模塊一的天然T域有效互作,導(dǎo)致雜合酶無(wú)活性;(2)現(xiàn)有理論顯示,亞基間的對(duì)接域可指導(dǎo)非核糖體肽合成酶正確的線性排列,并介導(dǎo)亞基間的互作,該實(shí)驗(yàn)中PvdD模塊一的CA域替換后無(wú)法與上游亞基PvdJ正確對(duì)接(圖3b)骡苞。

Tanovic等,在對(duì)枯草芽孢桿菌中的脂肽抗生素合成酶最末端模塊SrfA-C的結(jié)構(gòu)研究后發(fā)現(xiàn),其縮合域(C域)和腺苷酰化域(A域)之間有一段含32個(gè)氨基酸的連接區(qū),在SrfA-C晶體結(jié)構(gòu)中,該連接區(qū)與C域楷扬、A域均緊密相連解幽。因此,人們認(rèn)為在模塊替換時(shí)需保持CA域結(jié)構(gòu)完整,C域與A域應(yīng)作為不可分割的整體才能避免破壞雜合酶的結(jié)構(gòu)和活性『嫫唬基于此現(xiàn)象,Calcott等繼續(xù)用異源CA域替換PvdD亞基第二個(gè)模塊CA域躲株。與該團(tuán)隊(duì)早期替換PvdD亞基第一個(gè)模塊CA域不同,替換PvdD亞基第二個(gè)模塊CA域可避免破壞PvdD與上游亞基PvdJ間的相互作用(圖3b)。結(jié)果顯示,有兩個(gè)雜合NRPS具有較好的催化活性,并獲得了兩種Thr11和Lys11取代的pyoverdine類似物,產(chǎn)量分別是野生型的83% 和76%,其余6個(gè)雜合酶均無(wú)活性镣衡。

2 融合邊界

在初期研究中,從保證模塊功能完整性的角度考慮,研究者通常以A結(jié)構(gòu)域或一個(gè)完整的CAT(E)模塊單元對(duì)NRPS進(jìn)行替換等改造霜定。例如,以T-C域間連接區(qū)為融合邊界替換達(dá)托霉素非核糖體肽合成酶的完整CAT模塊。然而完整CAT(E)模塊交換存在產(chǎn)量急劇下降的問(wèn)題,且要求蛋白質(zhì)序列具有高同源性,有一定的局限性廊鸥。理解結(jié)構(gòu)域間的連接區(qū)在非核糖體肽合成酶催化底物活化望浩、加載、縮合過(guò)程中的作用,對(duì)于通過(guò)模塊替換獲取較好催化活性的雜合NRPS有重要作用惰说。

2.1 以A-T域間連接區(qū)為融合邊界

Miller等,通過(guò)生物信息學(xué)分析了不同NRPS的A-T域間連接區(qū)后,在A-T域的連接區(qū)發(fā)現(xiàn)了一段保守的LPxP序列,該LPxP序列與A域C端的亞域相互作用以穩(wěn)定A10基序中的保守賴氨酸;此外,該基序與A域C端的亞域相互作用可能會(huì)協(xié)調(diào)PCP域的運(yùn)動(dòng)與A域的構(gòu)象變化磨德。將LPxP序列中的Pro961突變后導(dǎo)致產(chǎn)物合成速率下降近一半。同時(shí)有研究將發(fā)光桿菌(Photorhabdus luminescens)中單模塊靛藍(lán)合成酶IndC的T域用來(lái)自鏈霉菌的BpsA酶的T域替換后,破壞了靛藍(lán)合成;令人驚奇的是,將BpsA酶的T域與A-T域間的連接區(qū)一起交換時(shí)恢復(fù)了靛藍(lán)合成。上述實(shí)驗(yàn)表明選擇并保留合適的結(jié)構(gòu)域間連接區(qū)對(duì)某些模塊替換獲得有活性的雜合NRPS至關(guān)重要典挑。Calcott等曾用CA域替換PvdD第二個(gè)模塊(1.3),然而僅少數(shù)雜合NRPS具有較好催化活性,大多數(shù)雜合NRPS無(wú)功能酥宴。隨后,該團(tuán)隊(duì)以A-T間連接區(qū)為融合邊界替換合成酶PvdD中T-C-AThr11催化單元(圖3b)。雖然成功獲得了兩種Ser11和fhOrn11取代的pyoverdine衍生物,但是這兩個(gè)衍生物的產(chǎn)量都較低您觉。

2.2 以C-A間保守序列為融合邊界替換A-T-C域

近年來(lái)德國(guó)法蘭克福大學(xué)Bode團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)CA結(jié)構(gòu)域之間的連接區(qū)含一段保守序列LLLxxWNxT拙寡。利用此邊界節(jié)點(diǎn),在NRPS兩個(gè)模塊(CAT-CAT)之間選擇AT-C區(qū)域?yàn)樘鎿Q單元(exchange unit,XU)進(jìn)行模塊替換能獲得活性較高的雜合NRPS蛋白,某些替換組合非核糖體肽的產(chǎn)量甚至比野生型提高了48%(圖4b)。以A-T-C結(jié)構(gòu)域作為交換單元進(jìn)行模塊替換和組合雖然取得了重大突破,而且可以進(jìn)行多模塊同時(shí)替換和組裝,但這個(gè)方法局限性明顯:首先,CA結(jié)構(gòu)域之間的保守序列LLLxxWNxT在很多NRPS蛋白序列中并不存在顾犹。其次,現(xiàn)有理論顯示C域?qū)M(jìn)入該結(jié)構(gòu)域的氨酰-S-PCP受體具有很高的底物選擇性,當(dāng)雜合的A域識(shí)別的氨基酸與上游的C域不匹配時(shí),肽鏈無(wú)法延伸導(dǎo)致無(wú)目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)生倒庵。因此,在對(duì)NRPS進(jìn)行改造時(shí),不僅需要考慮雜合NRPS的催化效率,還需要考慮C域?qū)Φ孜锏倪x擇性,避免雜合的A域識(shí)別的氨基酸與上游C域不匹配時(shí)肽鏈無(wú)法延伸導(dǎo)致無(wú)目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)生。

2.3 替換CAsub-A-T-CDsub催化單元

通過(guò)對(duì)C域的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析,研究人員發(fā)現(xiàn)C域的N端是提供肽鏈的供體域(CDsub),C端是受體域(CAsub),它們分別接受肽基-S-PCP和氨酰-S-PCP炫刷。其中受體域(CAsub)對(duì)氨酰-S-PCP有特異識(shí)別作用擎宝。例如,Kaniusaite等對(duì)糖肽類抗生素(glycopeptide antibiotics,GPAs)NRPS的改造實(shí)驗(yàn)也表明,C域?qū)κ荏w底物氨酰-S-PCP有強(qiáng)選擇性。也有研究顯示,C域不僅對(duì)受體底物氨酰-S-PCP有選擇性,對(duì)供體底物肽基-S-PCP的大小和組成也有選擇性浑玛。對(duì)C域的結(jié)構(gòu)解析也發(fā)現(xiàn)其具有立體和側(cè)鏈選擇性绍申。基于此理論Bozhüyük等于2019年進(jìn)一步開(kāi)發(fā)了第二代的替換方案:用CAsub-A-T-CDsub作為基本的替換單元(exchange unit condensation domain,XUC)進(jìn)行整體替換顾彰。該方案避免了雜合A域和C域之間氨基酸底物識(shí)別不匹配的問(wèn)題,明顯具有更廣的適用范圍,且該催化單元避免了破壞最主要的結(jié)構(gòu)域-結(jié)構(gòu)域相互作用,有的多肽產(chǎn)量比野生型提高了63.4%(圖4c)极阅。利用該方法可以構(gòu)建多種隨機(jī)組合的類似天然的非核糖體肽庫(kù)。然而CAsub-A-T-CDsub作為交換單元的局限性在于:來(lái)源于同屬的模塊間易融合,而來(lái)源于不同屬的模塊間缺乏兼容性;TE結(jié)構(gòu)域?qū)Π被嵛恢谜窍怼㈦逆滈L(zhǎng)度或環(huán)肽大小的特異性限制了全新的非天然筋搏、非核糖體肽以及環(huán)肽、縮肽形成厕隧。

2.4 利用合成拉鏈在C-A邊界處高效雜合催化模塊

盡管以CAsub-A-T-CDsub為替換單元可以構(gòu)建結(jié)構(gòu)多樣的非核糖體肽庫(kù),但是NRPS的巨型結(jié)構(gòu)和保守的重復(fù)序列使得對(duì)其進(jìn)行基因操作比較復(fù)雜和困難;此外,對(duì)功能域結(jié)構(gòu)了解不足有時(shí)會(huì)導(dǎo)致人們?cè)趯?duì)NRPS進(jìn)行催化單元替換重組時(shí)破壞了域間的對(duì)接域,也限制了替換對(duì)接域這一方案奔脐。2021年,Reinke等和Thompson等用一對(duì)人工合成的短肽作為“拉鏈”(synthetic zippers,ZPs)替代NRPS結(jié)構(gòu)域間的對(duì)接域,介導(dǎo)雜合催化模塊間的相互作用。一對(duì)拉鏈以非共價(jià)作用相互結(jié)合,并以C-A間的保守序列LLLxxW]-[NxT作為插入位點(diǎn),由此介導(dǎo)兩個(gè)亞基或催化模塊間的結(jié)合吁讨。Bozhueyuek等用此方法合成了大量多肽,有的組合非核糖體肽的產(chǎn)量甚至比普通融合方式提高了8倍 (圖5b)髓迎。

此方法避免了克隆和非核糖體肽合成酶大小的限制,可隨機(jī)組合任意的NRPS模塊,為快速實(shí)現(xiàn)新高通量生物組合方法、開(kāi)發(fā)多肽類藥物鋪平了道路建丧。

3 C域與A域的相互作用

3.1 C域改變A域的活性和選擇性

從上述經(jīng)典的NRPS生物合成理論可知,A域特異性識(shí)別氨基酸底物進(jìn)行腺苷跖帕洌基化,C域在氨基酸縮合過(guò)程對(duì)受體氨酰-S-PCP的種類進(jìn)一步校對(duì)驗(yàn)證(proofreading),A域和C域在底物選擇過(guò)程中各自獨(dú)立發(fā)揮作用,共同確保所合成非核糖體肽結(jié)構(gòu)專一。但近年的研究報(bào)道顯示C域?qū)ζ湎噜徬掠蜛域的底物選擇性產(chǎn)生影響翎朱。Mayer等,將A域進(jìn)行單獨(dú)表達(dá)后,它可以腺苷蹰衔基化多種氨基酸底物,但和C域聯(lián)合表達(dá)后,A域只對(duì)精氨酸具有腺苷酰基化活性;單獨(dú)表達(dá)A域時(shí)對(duì)天然底物酪氨酸和色氨酸均無(wú)活性,與C域聯(lián)合表達(dá)后對(duì)這兩種氨基酸具有腺苷跛┣基化活性挣郭。表明C域與A域的相互作用改變了A域的底物特異性,且某些A域只有在C域存在的條件下才具有活性。

此外,很多非脂肽類NRPS的起始模塊并不含有C域,起始模塊的A域腺苷趿圃希基化氨基酸后通過(guò)T域直接轉(zhuǎn)移到下一模塊的C域進(jìn)行氨基酸縮合。但是若采用NRPS延伸模塊A域直接替代起始單元A域,目前尚未見(jiàn)肽鏈延伸成功的報(bào)道侄非。近期Bozhüyük等,將C域(或C域C端的受體域CAsub)和延伸模塊A域共表達(dá)時(shí),成功地將延伸單元的A域轉(zhuǎn)變?yōu)槠鹗紗卧狝域,產(chǎn)生了目標(biāo)非核糖體肽化合物蕉汪。

有研究在交換AT域時(shí)把C域C端作為雜合位點(diǎn),雜合蛋白具有較高產(chǎn)量流译。與最早的AT域替換通常導(dǎo)致產(chǎn)量下降相反,該實(shí)驗(yàn)中AT域的成功交換表明C-A間的相互作用界面對(duì)A域發(fā)揮活性功能很重要,當(dāng)雜合的異源A域或AT域或AT-C域不包含此相互作用界面時(shí),異源A域無(wú)法與上游C域正確互作,因此A域活性喪失,雜合NRPS無(wú)法發(fā)揮功能。上述實(shí)驗(yàn)表明在NRPS中每一組催化模塊的C域和A域并非各自獨(dú)立發(fā)揮作用完成一輪氨基酸延伸,C域與A域發(fā)生交互作用完善了A域腺苷跽甙蹋基化的功能福澡。

3.2 關(guān)于C域底物選擇性的爭(zhēng)議

近20年來(lái),研究者們普遍認(rèn)為A域和C域在底物選擇和“校正”中都起著關(guān)鍵作用,這一假說(shuō)極大地復(fù)雜了NRPS的理性化組合生物合成。通過(guò)生物信息學(xué)分析A域的蛋白質(zhì)序列,發(fā)現(xiàn)其對(duì)氨基酸底物的選擇有很大保守性,甚至可以通過(guò)A域蛋白質(zhì)序列大致預(yù)測(cè)其氨基酸底物的種類驹马。但是C域的蛋白質(zhì)序列對(duì)應(yīng)相同氨酰-S-PCP底物無(wú)特殊規(guī)律或保守性革砸。在天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)中一個(gè)鈣離子依賴的脂肽抗生素合成酶的第一個(gè)C域(CDA-C1)負(fù)責(zé)催化供體2,3-epoxyhexanoyl ACP與絲氨酸-S-PCP的縮合。但是加拿大麥吉爾大學(xué)Martin Schmeing課題組通過(guò)喂養(yǎng)其他受體底物(丙氨酸-,亮氨酸-,甲硫氨酸-S-PCP)時(shí)發(fā)現(xiàn),這些受體底物也可以與供體2,3-epoxyhexanoyl ACP進(jìn)行縮合糯累。此外,Schoppet等?的最新研究結(jié)果也表明C域?qū)Φ孜锞哂袑挿旱倪x擇性及立體結(jié)構(gòu)的容忍性算利。Calcott等的研究也對(duì)C域的受體底物特異性這一理論提出了質(zhì)疑和反駁。Ackerley等[22]和Calcott等通過(guò)選擇有效的重組邊界,在pyoverdine NRPS中交換A域的成功率很高,pyoverdine類似物的產(chǎn)量?jī)?yōu)于該團(tuán)隊(duì)先前以CA作交換單元時(shí)的產(chǎn)量(圖5a)泳姐。

據(jù)此,結(jié)合生物信息學(xué)分析,研究者認(rèn)為C結(jié)構(gòu)域受體底物的特異性不是阻礙對(duì)NRPS工程化改造的因素效拭。Calcott等,將PheATE- ProCAT模型中ProCAT模塊A域以上述重組邊界交換為L(zhǎng)-Leu的A域后,成功合成了D-Phe- L-Leu,反駁了C域受體底物特異性這一假說(shuō),證明在交換NRPS催化模塊時(shí),通過(guò)選擇有效的重組邊界即可交換A域,實(shí)現(xiàn)對(duì)非核糖體肽生物合成途徑改造,獲取新的非核糖體肽。Calcott的實(shí)驗(yàn)對(duì)普遍公認(rèn)的C域受體底物特異性這一理論提出了巨大挑戰(zhàn)胖秒。然而其二肽合成中僅以識(shí)別L-Leu的A域交換ProCAT,因此存在偶然性,缺少對(duì)其他氨基酸特異的A域交換結(jié)果缎患。

4 總結(jié)與展望

設(shè)計(jì)非核糖體肽的生物合成途徑,以產(chǎn)生具有新結(jié)構(gòu)或更好藥理活性的新型化合物,一直是天然產(chǎn)物合成生物學(xué)的目標(biāo)⊙指危基于非核糖體肽合成酶的線性催化機(jī)制,理論上定向重組催化模塊可以獲得任意氨基酸序列組合的多肽挤渔。然而雜合NRPS的催化效率限制了其可行性和實(shí)用性。隨著對(duì)NRPS各功能域的結(jié)構(gòu)研究日益深入,選擇合適的催化單元和理想的重組邊界使雜合NRPS可識(shí)別加載目的底物和提高其催化效率成為可能风题。因此,合理設(shè)計(jì)構(gòu)建策略,允許催化單元任意重組,從而高效合成自然界尚未存在的化合物,對(duì)增加非核糖體肽家族化合物多樣性判导、開(kāi)發(fā)新藥具有重大意義。

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