摘要：
番茄的風(fēng)味依賴多種揮發(fā)物的混合作用践瓷，包括多種醋酸酯亡蓉。紅果番茄與綠果番茄相比淋肾，積累的相對低的醋酸酯含量爸邢。研究發(fā)現(xiàn)杠河，紅果和綠果種之間揮發(fā)性酯含量的差異與插入一個與酯酶家族中最具酶活性的成員相鄰的轉(zhuǎn)座子有關(guān)感猛。這種插入導(dǎo)致酯酶的高表達(dá)陪白，導(dǎo)致與人類對番茄的偏好負(fù)相關(guān)的多個酯的水平降低。這種插入在紅果種進(jìn)化中固定下來咱士，表明酯酶的高表達(dá)和隨后的低酯含量可能為紅果種的祖先提供了適應(yīng)性優(yōu)勢立由。這些結(jié)果表明在分子水平上轧钓，親緣關(guān)系密切的物種通過改變與揮發(fā)性相關(guān)的分解代謝活性而在揮發(fā)性物質(zhì)產(chǎn)生方面表現(xiàn)出重大差異。
背景：
- 食物的香味包括味覺和嗅覺感受器所檢測到的信息的整合锐膜。在番茄（Solanum lycopersicum）中毕箍，風(fēng)味是糖、酸和多種揮發(fā)性化學(xué)物質(zhì)之間相互作用的總和道盏。雖然糖和酸是我們對番茄的品嘗必不可少的而柑，但其風(fēng)味的獨特性和復(fù)雜性取決于能被檢測到的揮發(fā)物的混合物。荷逞。植物合成大量揮發(fā)性有機化合物涩澡。它們來源于初級和次級代謝產(chǎn)物粥帚，具有多種功能宪郊，如防御草食動物和病原體、植物與植物之間的相互作用、吸引傳粉者和種子散布者等。大多數(shù)重要的番茄揮發(fā)物來自氨基酸钧唐、脂肪酸和類胡蘿卜素前體帅韧。盡管這些揮發(fā)物對果實品質(zhì)的重要性很高，但它們的合成規(guī)律仍然知之甚少。
- 植物揮發(fā)性物質(zhì)產(chǎn)生相關(guān)基因的鑒定方法之一是基于QTL（quantitativetrait locits）的特性。這種方法利用了同一物種栽培品種間或近緣物種間的差異。在番茄中，僅含有野生種基因組片段的導(dǎo)入系（ILs）群體已被用于發(fā)現(xiàn)大量與揮發(fā)性相關(guān)的QTL，以及影響產(chǎn)量、類胡蘿卜素產(chǎn)量和初級代謝產(chǎn)物累積的QTL。從人類口味的角度來看，將注意力集中在消費者偏好最重要的揮發(fā)物上是最有意義的别惦。從理論上講益楼，最重要的揮發(fā)物是根據(jù)氣味單位來確定的，也就是，一種給定的揮發(fā)物的濃度除以其氣味閾值。盡管這種方法有價值，但最近的研究表明，由于揮發(fā)物和其他風(fēng)味相關(guān)化學(xué)物質(zhì)之間的相互作用影響感知，味覺偏好的現(xiàn)實情況要復(fù)雜得多。消費者偏好調(diào)查小組對大量不同種類的番茄品種進(jìn)行了調(diào)查马胧，確定了一組與偏好正相關(guān)或負(fù)相關(guān)的揮發(fā)物威彰。
- 由于不同番茄物種受到不同物種豹缀、生物脅迫、傳粉者和種子分散的能力等選擇的影響叮雳，因此在番茄分支中存在很大的多樣性寞焙。根據(jù)果實性狀模她，可將其分為兩個亞類。一組由具有特征的物種組成至少從人類的角度來看途事，是不好吃的綠色水果。第二類，包括S. lycopersicum和S. pimpinellifolium，生產(chǎn)可食用的紅色水果惕稻。Solanum cheesmaniae和Solanum galapagense也可以放在后者中肺然，因為它們有彩色的果實，并且在遺傳上與S. lycopersicum緊密相關(guān)蔫敲。S. cheesmaniae和S.galapagense產(chǎn)生黃色和橙色果實伯诬，并且是Galapagos的地方特色闽瓢。S. cheesmaniae和S. galapagense的果實雖然可以使用销钝，但是由于有刺激性的氣味而不如S. lycopersicum和S. pimpinellifolium好吃。從進(jìn)化的角度來看滤祖，有色水果物種形成了一個單系群扬绪。綠果種Solanum chmielewskii和Solanum neorickii是一個不同分支。Solanum pennellii和Solanum habrochaitesare 從S. lycopersicum中進(jìn)一步分離。
- 揮發(fā)性酯類化合物是一類重要的化合物翰舌，對許多水果和花卉的香氣有貢獻(xiàn)山橄。例如睡雇，乙酸酯是香蕉（3-甲基乙酸丁酯）、茉莉（乙酸芐酯）和蘋果酸（多酯）香氣的關(guān)鍵混移。盡管每種化合物的感官特性不同，但醋酸酯通常具有水果或花香的香味。乙酸酯揮發(fā)物是由醇乙酰轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生的辑舷，這些酶能濃縮醇，通常也產(chǎn)生揮發(fā)性化合物勃刨，以及乙酰輔酶A波材。除了在水果和花卉中發(fā)現(xiàn)，醋酸酯也存在于營養(yǎng)組織中身隐。例如廷区，乙酸順-3-己烯基酯是機械和食草動物破壞植物釋放出的大量的化合物之一，表明其在植物防御中的作用贾铝。更重要的是隙轻，這種揮發(fā)性物質(zhì)還能夠激發(fā)植物的防御反應(yīng)埠帕，在植物間的相互作用中起重要作用。
- 在這里玖绿，我們發(fā)現(xiàn)醋酸酯與消費者對番茄水果的喜好呈負(fù)相關(guān)敛瓷。基于它們對消費者偏好的潛在負(fù)面影響以及它們對植物防御的潛在貢獻(xiàn)斑匪，我們感興趣的是這些化合物的含量是如何被調(diào)控的呐籽。為了確定最重要的酯積累調(diào)節(jié)因子，我們使用了從番茄的野生近緣種S.pennelliands和S. habrochaites獲得的ILs蚀瘸。利用這些IL群體狡蝶，鑒定了一個控制揮發(fā)性酯含量的主效QTL。
結(jié)果
番茄葉中的酯揮發(fā)物
- 我們之前篩選了heirloom西紅柿品種大量不同化學(xué)成分贮勃，并將它們的濃度與消費者的喜好聯(lián)系起來贪惹。消費者喜好得分與個體乙酸酯類和阿斯托乙酸酯類占揮發(fā)物總量百分比的相關(guān)分析表明，兩者呈顯著負(fù)相關(guān)寂嘉。這種物質(zhì)與喜好的負(fù)相關(guān)性表明奏瞬，降低番茄果實中乙酸酯類的含量是可取的。
- 為了深入了解番茄中醋酸酯的積累規(guī)律泉孩，我們研究了番茄多個品種野生品系中醋酸酯的變化硼端。野生種質(zhì)的揮發(fā)性成分在乙二醇總含量上有很大的差異（圖1）。與果實釋放的揮發(fā)物總量相比棵譬，S. lycopersicum和S. pimpinelli-folium的乙酸酯含量較低显蝌。相比之下，綠色水果品種積累了更高水平的乙酸乙酯订咸。在某些情況下曼尊，像S. pennellii，它們形成了被檢測到的最豐富的揮發(fā)物群之一脏嚷。毫不奇怪骆撇，在不同的物種和種類之間，每個酯的揮發(fā)性比例是不同的父叙。這表明決定每一酯含量的因素是多方面的神郊，包括底物利用率、乙酰轉(zhuǎn)移酶含量和特異性以及酯酶活性趾唱。盡管在特定的酯水平上存在差異涌乳，但紅果種的乙酸酯總含量實際上低于綠果種。綠色水果品種的整體香氣中含有明顯的酯類揮發(fā)物甜癞，可以描述為水果味和香蕉味夕晓。S. cheesmaniae和S. galapagense在一定程度上比S. lycopersicum和S. pimpinellifolium積累更多的縮醛酯。
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- 為確定紅悠咱、綠果樹品種間乙酸乙酯含量變化的原因蒸辆，從番茄與紅征炼、綠果S. pennellii和S. habrochaites的雜交中分離出兩個IL群體。一些酯含量更高的品系含有一個來自于野生種的1號染色體底部的公共片段（表1和圖1）躬贡。S1）谆奥，表明一個QTL影響了酯含量。這些系列中最豐富的酯是順-3-己烯基乙酸酯拂玻、乙酸己酯酸些、乙酸2-甲基丁酯、乙酸異丁酯和乙酸3-甲基丁酯纺讲。擂仍。盡管每種化合物含量的增加有所不同囤屹，但QTL影響了所檢測到的所有醋酸酯熬甚。進(jìn)一步精細(xì)定位允許我們將QTL定位到700 kb的區(qū)域。對基因組序列的分析表明肋坚，在內(nèi)含子片段中存在一組同源的乡括、排列整齊的酯酶基因（88-92%的DNA同源性）。根據(jù)酶學(xué)原理智厌，這些酯酶可分為羧基酯酶诲泌。羧酸酯酶水解羧酸酯生成醇和羧酸鹽（圖2）。因此铣鹏，酶被注釋為SlCXE1–SlCXE5敷扫。定量PCR分析顯示，只有LCX1在成熟果實中高表達(dá)诚卸，SlCXE2–SlCXE5的總轉(zhuǎn)錄水平低于總轉(zhuǎn)錄水平的0.3%（表S3）葵第。在不同組織和果實發(fā)育的不同階段也分析了SLCX1的表達(dá)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物主要存在于果實中合溺，在果實成熟過程中表達(dá)增加卒密。
番茄中slCXE1基因的沉默
- 為了確定這種候選的酯酶基因是否與QTL相關(guān)的更高的酯水平有關(guān)，通過基因沉默的轉(zhuǎn)基因植物來評估其功能棠赛。在Flora-Dade背景下哮奇，獲得了幾個SlCXE1基因表達(dá)量降低的品系。由于slCXE1和slCXE2–slCXE5高度同源睛约，盡管與slCXE1的程度不同鼎俘，這些系的其他四個基因的轉(zhuǎn)錄物含量降低。三個SlCXE1表達(dá)量只有不到對照的6%的株系成熟果實的揮發(fā)物含量與對照品系成熟果實揮發(fā)物含量的變化見圖3辩涝。
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- 在基因沉默的株系中觀察到乙酸酯的含量與ILs的QTL中的含量相近贸伐。這一結(jié)果證實了slCXE1在調(diào)節(jié)番茄果實酯含量中的作用。
slCXE1的酶活性
- 根據(jù)番茄基因組序列膀值，slCXE1與其他四種酯酶（slCXE2–5）相比棍丐，在蛋白質(zhì)的中間插入了27個氨基酸（圖4）误辑。這種CXE1直系同源基因的插入物存在于該屬內(nèi)所有物種中，包括Solanum tuberosum歌逢。然而巾钉，我們無法在NCBI數(shù)據(jù)庫的任何其他酯酶中發(fā)現(xiàn)這種插入。乙酰酯酶中這種插入物的存在似乎僅限于茄科植物秘案，而且可能僅限于Solanum屬植物砰苍。來源于綠色果實的ILs中所有乙酸酯的增加表明slCXE1具有廣泛的活性。為了證實這一點阱高，我們檢測了重組slCXE1酶的體外活性赚导。由于酶中間插入物的存在會影響酶的活性，因此截短了slCXE1（圖4）赤惊。截斷形式（slCXE1del）缺少slCXE1的唯一序列吼旧，因此更類似于slCXE2–5。slCXE1未舟、slCXE1del和slCXE5在大腸桿菌BL21中表達(dá)并純化圈暗。slCXE5是剩余4個基因中表達(dá)最高的（盡管水平遠(yuǎn)低于slCXE1）。利用番茄中檢測到的醋酸酯測定了三種酶的親和常數(shù)（Km）和周轉(zhuǎn)數(shù)（kcat）裕膀。正如預(yù)期的那樣员串，slCXE1對所有測試的乙酸酯都顯示出活性，盡管該酶在一些底物（包括3-甲基乙酸丁酯和乙酸己酯）中更為活躍昼扛。動力學(xué)參數(shù)與其他羧酸酯酶的公開值相似寸齐。有趣的是，截短型的slCXE1只保留了對不同底物的小部分活性抄谐，其活性與slCXE5相當(dāng)渺鹦。
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番茄中CxE1的5’端近端序列的差異
- 為了確定綠色果樹中觀察到的高酯含量是否是由于CXE1的差異表達(dá)所致，測定了LA3916斯稳、Il-1-4及其各自與親本LA4024和M82的mRNA水平海铆。S. pennelli和S. habrochaites和他們的親本相比都有低CXE1的表達(dá)（圖5）。RNA含量的降低與ILs中乙酸酯含量的升高有關(guān)挣惰。我們還想知道與番茄相比卧斟，是否綠色果實CXE2-5的表達(dá)也同樣減少。與CXE1相比憎茂，CXE2-5的表達(dá)水平?jīng)]有實質(zhì)性的減少珍语，而在水果中表達(dá)較弱。因此竖幔，我們得出結(jié)論S. lycopersicum中油酯的的減少與CXE1轉(zhuǎn)錄本的高水平表達(dá)相關(guān)板乙。
- S. lycopersicum中CXE1的高水平表達(dá)表明在番茄和S. pennellii和S. habrochaites的漸滲系之間存在差異。因此，我們測定了番茄和ILs雙親的啟動子區(qū)DNA序列募逞。西紅柿的啟動子區(qū)域在接近（110 bp）到預(yù)測的ORF的起始密碼子位置含有2300的插入（圖5）蛋铆。通過與植物重復(fù)數(shù)據(jù)庫的比對，我們可以將插入物識別為類似copia的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子放接。類copia逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的序列在番茄基因組中非常豐富刺啦，盡管長末端重復(fù)序列（LTR）中的替換表明它們現(xiàn)在大多處于活動狀態(tài)。對番茄基因組網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫中的slCXE1 ESTs的分析表明纠脾，該基因的5′UTR在轉(zhuǎn)座子的LTR內(nèi)延伸玛瘸，表明轉(zhuǎn)座子含有啟動子元件，導(dǎo)致番茄果實中高表達(dá)苟蹈。
- 我們感興趣的是確定逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的存在是否與物種間的酯水平相關(guān)糊渊，因此，我們對來自8個物種的5′到CXE1區(qū)域進(jìn)行了測序慧脱。S. pimpinellifolium啟動子區(qū)也含有類似copia的轉(zhuǎn)座子渺绒。同樣的插入也在S. galapagense和S. cheesmaniae中發(fā)現(xiàn)。然而磷瘤，沒有一個綠色果實的物種（S.pennelli芒篷，S.habrochaites搜变，S.neorickii采缚，S. chmielewskii）包含逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。這一觀察表明挠他，轉(zhuǎn)座子插入時間比綠果和紅果物種之間的分化要晚扳抽。通過假設(shè)插入時逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的兩個LTR是相同的，可以估計插入事件發(fā)生在～220萬年前殖侵。這一估計將轉(zhuǎn)座子插入紅果種和綠果種之間的差異之后贸呢，但在紅果種組內(nèi)的物種形成之前。
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討論
鑒定影響風(fēng)味的基因一直是提高家養(yǎng)果蔬品質(zhì)的重要途徑拢军。包括西紅柿楞陷、甜瓜和草莓在內(nèi)的幾種作物的商業(yè)品種經(jīng)常被看到缺乏對消費者的吸引力。現(xiàn)代育種具有產(chǎn)量茉唉、抗病性固蛾、外觀、采后貨架期等重要性狀度陆。大量影響揮發(fā)物產(chǎn)生的基因以及對揮發(fā)物缺乏認(rèn)識艾凯，對育種家提出了重大挑戰(zhàn)。揮發(fā)物途徑的表征將提供有價值的工具懂傀，將其作為育種過程的重要組成部分趾诗。在本研究中，slCXE1被認(rèn)為是果實中酯揮發(fā)物含量的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子蹬蚁。番茄中slCXE1的表達(dá)相對較高恃泪，結(jié)果是醋酸酯含量較低郑兴，影響了果實的揮發(fā)性，從而影響了果實的整體香氣贝乎。盡管slCXE1在酯的總含量中起著一定的作用杈笔，但其他因素可能會影響每個乙酸酯的含量。特別是糕非，乙醇乙酰轉(zhuǎn)移酶的底物池和底物特異性可能影響番茄和不同野生種中不同酯的積累蒙具。因為在公布的番茄基因組序列中，沒有一個已知的醇乙酰轉(zhuǎn)移酶能mapping到1號染色體的底部朽肥，與1號染色體QTL相關(guān)的酯含量的大幅度增加表明了lcxe1在區(qū)分綠色和紅色果實物種中的重要作用禁筏，這一假設(shè)與轉(zhuǎn)基因植株中觀察到的酯變化一致『庹校總之篱昔，研究結(jié)果強調(diào)了分解代謝在測定植物揮發(fā)物總含量中的重要性。
在slCXE1的中心插入27個氨基酸的獨特序列始腾，顯著提高了酶的親和力和轉(zhuǎn)化率州刽。去除該序列降低了slCXE1對所有被測醋酸酯的親和力和轉(zhuǎn)化率痕鳍。特別有趣的是只嚣，這種活動上的差異是我們沒有在Solanum外的任何酯酶中發(fā)現(xiàn)這種插入序列。SlCXE1及其旁系同源基因SlCXE5（圖4）的計算機模擬表明客蹋，該插入物位于酶活性位點附近奶栖。因此匹表，這種插入可能有助于更有效地粘合和/或翻轉(zhuǎn)基底。
獨特的27個氨基酸插入slCXE1導(dǎo)致了相對其旁系同源酶活性的顯著提高宣鄙。綜上所述袍镀，這些結(jié)果證實了slCXE1在決定番茄風(fēng)味中的重要作用。slCXE1的高表達(dá)與該基因啟動子區(qū)出現(xiàn)類似copia的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子有關(guān)冻晤。類Copia逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在番茄基因組中非常豐富苇羡，可能是物種多樣性的重要來源。逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子基因的轉(zhuǎn)錄啟動子可以對其表達(dá)產(chǎn)生不利的影響鼻弧∩杞…… 反轉(zhuǎn)錄因子也可以積極影響基因表達(dá)∥率……
反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的插入最有可能發(fā)生在番茄枝內(nèi)綠色和紅色果實品種分化后绣硝。
番茄枝內(nèi)綠色和紅色果實種類之間的酯揮發(fā)分含量差異表明，親緣關(guān)系密切的種類已經(jīng)進(jìn)化到積累不同的揮發(fā)物平衡撑刺。
綜上所述鹉胖，我們已經(jīng)證明，紅、綠果實番茄品種間的揮發(fā)性酯酶含量的差異與轉(zhuǎn)座因子直接插入酯酶家族中最具酶活性成員的5′有關(guān)甫菠，這種插入事件的結(jié)果是降低了多種酯類的含量挠铲，這與人類偏好呈負(fù)相關(guān)。
材料方法
略
reference:
Goulet, C. , et al. "Role of an esterase in flavor volatile variation within the tomato clade." Proceedings of the National Academy of Sciences 109.46(2012):19009-19014.
