WGCNA原理及應(yīng)用
WGCNA介紹：
WGCNA（weighted gene co-expression network analysis吝梅，權(quán)重基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析）是一種分析多個(gè)樣本基因表達(dá)模式的分析方法赃阀，可將表達(dá)模式相似的基因進(jìn)行聚類篮绰，并分析模塊與特定性狀或表型之間的關(guān)聯(lián)關(guān)系搞乏，因此在疾病以及其他性狀與基因關(guān)聯(lián)分析等方面的研究中被廣泛應(yīng)用扶欣。
WGCNA算法是構(gòu)建基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的常用算法（詳解：http://www.reibang.com/p/94b11358b3f3）仗考。WGCNA算法首先假定基因網(wǎng)絡(luò)服從無尺度分布音同，并定義基因共表達(dá)相關(guān)矩陣、基因網(wǎng)絡(luò)形成的鄰接函數(shù)痴鳄，然后計(jì)算不同節(jié)點(diǎn)的相異系數(shù)瘟斜，并據(jù)此構(gòu)建分層聚類樹(hierarchical clustering tree)，該聚類樹的不同分支代表不同的基因模塊(module)痪寻，模塊內(nèi)基因共表達(dá)程度高螺句，而分屬不同模塊的基因共表達(dá)程度低。最后橡类，探索模塊與特定表型或疾病的關(guān)聯(lián)關(guān)系蛇尚，最終達(dá)到鑒定疾病治療的靶點(diǎn)基因、基因網(wǎng)絡(luò)的目的顾画。在該方法中module被定義為一組具有類似表達(dá)譜的基因取劫，如果某些基因在一個(gè)生理過程或不同組織中總是具有相類似的表達(dá)變化匆笤，那么我們有理由認(rèn)為這些基因在功能上是相關(guān)的，可以把他們定義為一個(gè)模塊(module)谱邪。這似乎有點(diǎn)類似于進(jìn)行聚類分析所得到結(jié)果炮捧，但不同的是，WGCNA的聚類準(zhǔn)則具有生物學(xué)意義惦银，而非常規(guī)的聚類方法(如利用數(shù)據(jù)間的幾何距離)咆课，因此該方法所得出的結(jié)果具有更高的可信度。當(dāng)基因module被定義出來后扯俱，我們可以利用這些結(jié)果做很多進(jìn)一步的工作书蚪，如關(guān)聯(lián)性狀，代謝通路建模迅栅，建立基因互作網(wǎng)絡(luò)等殊校。
WGCNA的用處：
這類處于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中心的基因稱為核心基因（hub gene），這類基因通常是轉(zhuǎn)錄因子等關(guān)鍵的調(diào)控因子读存，是值得我們優(yōu)先深入分析和挖掘的對象为流。
在網(wǎng)絡(luò)中，被調(diào)控線連接的基因宪萄，其表達(dá)模式是相似的艺谆。那么它們潛在有相似的功能。所以拜英，在這個(gè)網(wǎng)絡(luò)中静汤，如果線條一端的基因功能是已知的，那么就可以預(yù)測線條另一端的功能未知的基因也有相似的功能居凶。
下面的問答來自基迪奧虫给，也能加深對WGCNA的理解
問1、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)有什么區(qū)別侠碧？
答：調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是個(gè)更廣泛的概念抹估，而共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)是調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的一種。
理論上我們可以利用各類信息構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（表達(dá)相關(guān)性弄兜，序列靶向關(guān)系药蜻、蛋白互作關(guān)系），另外調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的信息既可以來源真實(shí)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的關(guān)系替饿，也可以來源生物信息的預(yù)測语泽。而共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)特指利用基因間的表達(dá)相關(guān)性預(yù)測基因間調(diào)控關(guān)系的方法，而WGCNA又是共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析中最有效的方法之一视卢。
問2踱卵、WGCNA分析適合的生物物種范圍有規(guī)定么？
答：沒有限制据过。對于任何物種中心法則都是存在的惋砂，調(diào)控關(guān)系對于任何物種都是存在的妒挎，所以WGCNA沒有物種限定。
問3西饵、同一物種酝掩，不同來源的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（比如不同文章/資料來源的），可以放在一起做WGCNA分析嗎罗标？
答：只要樣本間有相似的生物學(xué)意義庸队，是可以合并在一起做分析的。但要注意闯割，不同批次之間的樣本是有批次效應(yīng)的，所以可能會帶來一些誤差竿拆，但是是可以放在一起分析的宙拉。
問4、相同材料不同處理之間丙笋，可以放在一起做WGCNA分析嗎谢澈？比如重金屬和鹽堿處理。
答：可以的御板。這也正式WGCNA強(qiáng)大的地方锥忿，其可以將不同處理的樣本，合并在一起做分析怠肋。其他方法則不一定有這么強(qiáng)大的能力敬鬓，比如做基因表達(dá)趨勢分析時(shí)，如果樣本涉及到多個(gè)處理不同時(shí)期的時(shí)候笙各，就不好合并分析（或合并后難以解讀）钉答。但WGCNA的方法關(guān)注的是調(diào)控關(guān)系，所以不管是多少個(gè)處理組杈抢，都可以很好的整合在一起做分析数尿。
問5、不同批次的數(shù)據(jù)能放一起做WGCNA嗎惶楼？
答：可以的右蹦。雖然有批次的干擾，但是干擾對WGCNA網(wǎng)絡(luò)沒有太大影響歼捐。因?yàn)閃GCNA不是做差異分析何陆，而是基因的共表達(dá)。因?yàn)榕涡?yīng)理論上不影響相關(guān)性窥岩。
問6甲献、不同類型的材料，比如親本和F1颂翼，適合放一起進(jìn)行WGCNA么晃洒？
答：如果是一個(gè)作圖群體慨灭，當(dāng)然親本與F1是可以放在一起分析的，因?yàn)槟阒魂P(guān)心基因的表達(dá)模式球及，所以把親本加進(jìn)來是沒有問題的氧骤。
問7、沒有生物學(xué)重復(fù)吃引，共3組筹陵，每組5個(gè)時(shí)間點(diǎn)能夠做嗎？
答：理論上有15個(gè)樣本镊尺，是可以做WGCNA分析的朦佩。并且，分析出來的結(jié)果對你的研究應(yīng)該是非常有用的庐氮。至少他會比趨勢分析更有意義语稠，更加準(zhǔn)確。
問8弄砍、一般說WGCNA的樣品不少于15個(gè)仙畦，15個(gè)樣品考慮重復(fù)嗎？不同倍性的材料呢音婶？
答：15個(gè)樣本這個(gè)是包含了生物學(xué)重復(fù)慨畸，比如5個(gè)時(shí)間點(diǎn)3個(gè)重復(fù)；在RNA-seq里面建議不要用不同倍性材料加進(jìn)來衣式。除非是有參考的多倍體寸士，如果是無參的多倍體，不同倍性之間差異太大瞳收，會讓調(diào)控網(wǎng)絡(luò)不準(zhǔn)確碉京。所以用單一倍性的材料做調(diào)控網(wǎng)絡(luò)會更加準(zhǔn)確。
問9螟深、可以將RNA-seq數(shù)據(jù)與蛋白組數(shù)據(jù)谐宙，甲基化數(shù)據(jù)放一起做WGCNA分析？
答：不能與蛋白數(shù)據(jù)一起分析界弧。因?yàn)閃GCNA是基于相關(guān)系數(shù)的算法凡蜻。所以最好一起分析的數(shù)據(jù)變異度是類似的，RNAseq變異非常大垢箕，而蛋白的數(shù)據(jù)變異很小划栓，兩者的變化不在一個(gè)數(shù)量級上面。所以兩種數(shù)據(jù)放在一起分析不合理条获。
但RNA數(shù)據(jù)可以嘗試跟甲基化數(shù)據(jù)一起分析忠荞。當(dāng)然我們也建議RNA數(shù)據(jù)與代謝組數(shù)據(jù)一起分析，因?yàn)榇x組的數(shù)據(jù)變異也非常大。
問10委煤、表達(dá)量和表達(dá)的基因數(shù)目差異太大的樣品可以一起分析嗎堂油？比如樣品A有2k個(gè)gene表達(dá) 而樣品B有2w個(gè)gene表達(dá)了 AB可以一起分析嗎？
答：做WGCNA分析的時(shí)候碧绞，不能脫離生物學(xué)意義府框，既然要分析調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，那么應(yīng)該分析有相似生物學(xué)意義的一組基因讥邻，比如說拿相似組織來一起做分析迫靖，比如不應(yīng)該拿大腦的樣本與腳趾的樣本合并在一起做分析，因?yàn)楹茱@然兴使，這兩個(gè)組織沒有關(guān)聯(lián)系宜。如果兩個(gè)樣本之間是有相關(guān)聯(lián)的生物學(xué)意義，哪怕表達(dá)的基因數(shù)不一樣发魄，或表達(dá)模式差異很大蜈首，那依然可以放在一起分析；但如果樣本之間完全沒有生物學(xué)意義欠母，那么分析就沒有意義。
問11吆寨、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是case3個(gè)時(shí)間點(diǎn)（各點(diǎn)都有三個(gè)重復(fù)）赏淌，control同樣的3個(gè)時(shí)間點(diǎn)（每點(diǎn)三個(gè)重復(fù)），WGCNA怎么做啄清？3個(gè)時(shí)間點(diǎn)和case-control兩個(gè)因素能同時(shí)考慮進(jìn)來分析嗎六水？
答：可以的。做WGCNA是更加合理的辣卒，因?yàn)橛袃蓚€(gè)梯度的樣本掷贾，如果只是做差異分析的話，邏輯可能非常復(fù)雜荣茫，做WGCNA分析是對樣本特性更好的解析想帅，可以直觀看到基因在六個(gè)處理組里面是怎樣表達(dá)的。
問12啡莉、可以拿混合樣本分析嗎港准？比如一個(gè)病原細(xì)菌跟人類細(xì)胞的基因，能說明細(xì)菌跟人類細(xì)胞基因有調(diào)控關(guān)系嗎咧欣？
答：可以浅缸。前提是病原菌有足夠的數(shù)據(jù)并定量準(zhǔn)確，并且這個(gè)分析是非常有意義的魄咕，最后可以說明這些病原菌可以調(diào)控哪些宿主基因衩椒。
問13、但是病原宿主混合分析的話，宿主蛋白不能分泌到宿主體內(nèi)豈不是WGCNA生物學(xué)上也沒有意義嗎毛萌？
答：依然有意義苟弛。即使病原的基因沒有分泌到宿主里面，但是病原的蛋白是會影響宿主基因的調(diào)控的朝聋，比如某個(gè)細(xì)菌感染某個(gè)植物嗡午，雖然細(xì)菌的蛋白不能直接分泌到植物體內(nèi)，但會影響植物蛋白的分泌冀痕±蠖茫混在一起分析依然是有意義，可以看到植物里面到底哪個(gè)基因?qū)?xì)菌蛋白產(chǎn)生應(yīng)答作用言蛇。
問14僻他、芯片數(shù)據(jù)兩分類，每組20個(gè)樣本腊尚，能否每組單獨(dú)做WGCNA吨拗？
答：可以。WGCNA還有一種重要功能是做兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)的比較婿斥，比如病人20個(gè)樣本做一個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)劝篷，健康人做一個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，然后兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)做比較民宿。
問15娇妓、WGCNA可以用來分析lncRNA對下游基因的調(diào)控分析嗎？
答：可以活鹰。WGCNA網(wǎng)絡(luò)有利于預(yù)測lncRNA的潛在功能哈恰。
問16、構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)是用所有表達(dá)基因還是差異基因志群？
答：這個(gè)是具體問題具體分析着绷。如果使用所有的基因分析，會導(dǎo)致運(yùn)算量非常大锌云。而也不是所有的基因在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中都有生物學(xué)意義荠医，所以我們會提前做一些過濾。
但用于分析的基因不一定是差異表達(dá)基因宾抓，有時(shí)可以用差異表達(dá)基因做一個(gè)并集子漩，或通過計(jì)算變異系數(shù)將變異系數(shù)低的基因以及低表達(dá)的基因去除。但注意石洗，如果你有關(guān)心的特定目標(biāo)基因的話幢泼，應(yīng)該盡量給予保留。
問17讲衫、關(guān)注某一個(gè)pathway上的基因以及調(diào)控因子之間的相關(guān)性缕棵，構(gòu)建WGCNA網(wǎng)絡(luò)的時(shí)候?qū)儆谶@個(gè)pathway的基因數(shù)量太少會不會影響結(jié)果呢孵班？
答：這不是問題。在一個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)里面招驴，樣本的某個(gè)pathway上篙程，并不是所有基因參與調(diào)控（或存在差異性），所以在做WGCNA分析的時(shí)候别厘，會做一些過濾虱饿，將有變化的基因挑出來再做分析。即分析的是某個(gè)pathway上有變化的基因触趴，不需要分析pathway上所有的基因氮发，只需要分析那些變化的基因就夠了。
問18冗懦、前期篩選的時(shí)候爽冕，要選出在所有樣本中變異系數(shù)比較大的基因呢？還是直接用差異表達(dá)的基因取并集披蕉？用基因還是轉(zhuǎn)錄本颈畸，哪個(gè)好呢？
答：兩則都可以没讲，我推薦使用變異系數(shù)眯娱，選擇那些變異較大的基因，來做下面的分析爬凑。然后建議用基因不要用轉(zhuǎn)錄本困乒，因?yàn)檗D(zhuǎn)錄本的定量是不準(zhǔn)確的。
問19贰谣、變異系數(shù)一般取多大？
答：具體問題具體分析迁霎。例如吱抚，沒有特定目標(biāo)的時(shí)候，可以先計(jì)算變異系數(shù)考廉，將變異系數(shù)的百分之前50來做分析秘豹，把變異系數(shù)偏低的后面一半過濾掉。
問20昌粤、輸入數(shù)據(jù)用FPKM合適嗎既绕？
答：可以。
問21涮坐、RNA seq數(shù)據(jù)是RSEM值怎么辦凄贩？
答：RSEM值原始輸出結(jié)果為reads數(shù)，如果是RSEM值建議做一個(gè)RPKM校正再做分析袱讹。
問22疲扎、除了RPKM值以外，做WGANA是否還需要其他數(shù)據(jù)？TCGA數(shù)據(jù)可否來做WGCNA分析椒丧？
答：在做WGCNA分析必須要用表達(dá)量數(shù)據(jù)壹甥，但TCGA的數(shù)據(jù)某些層級沒有表達(dá)量數(shù)據(jù)，沒有表達(dá)量數(shù)據(jù)自然就無法做WGCNA分析壶熏。
問23句柠、請問輸入的基因樣本的矩陣的時(shí)候，要不要對數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化棒假？
答：做WGCNA分析的時(shí)候溯职，不需要對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，輸入RPKM值就足以做這個(gè)分析淆衷。雖然一些文章會做log2處理缸榄，但我認(rèn)為取了LOG2后，會讓一些表達(dá)關(guān)系沒有那么豐富祝拯。
問24甚带、每個(gè)樣本有3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，不需要對三個(gè)重復(fù)的表達(dá)量求平均值代表該樣本嗎佳头？
答：注意鹰贵，做WGCNA的時(shí)候每個(gè)樣本是獨(dú)立的，三個(gè)生物學(xué)重復(fù)樣本是全部導(dǎo)入做分析康嘉，不是取均值再做分析碉输，每個(gè)樣本都是獨(dú)立的。
問25亭珍、如果3個(gè)生物學(xué)重復(fù)敷钾，做WGCNA的時(shí)候是取三個(gè)值，還是用cuffdiff處理后取一個(gè)值肄梨？
答：如果是生物學(xué)重復(fù)樣本進(jìn)行調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析阻荒，每個(gè)樣本獨(dú)立使用，而不是取均值众羡。
問26侨赡、請問將樣本信息同模塊特征值進(jìn)行相關(guān)性分析的時(shí)候，樣本信息是怎么處理的呢粱侣？比如不同取樣點(diǎn)羊壹、不同性別什么的，這不是數(shù)量性狀信息的齐婴，這種情況應(yīng)該怎么處理呢油猫？
答：樣本的任何信息都可以做模塊相關(guān)性分析。比如相關(guān)時(shí)間點(diǎn)柠偶，可以按照先后量化為12134567眨攘。又如不同性別主慰，男與女，可以定義為1鲫售，-1共螺。任何性狀量化為數(shù)字后，都可以進(jìn)行相關(guān)性分析情竹。
問27藐不、怎么將模塊與性狀對應(yīng)起來呢有些性狀不好量化，如果直接將模塊與分組對應(yīng)秦效，如何實(shí)現(xiàn)雏蛮， 不需要量化指標(biāo)么？
答：首先需要將性狀量化阱州，如果無法將性狀量化挑秉，那么就無法分析。至于分組信息苔货，也可以量化為類似00001111000（1代表一種組別犀概，2代表另一組組別），實(shí)現(xiàn)分組信息的數(shù)字化夜惭。
問28姻灶、基因數(shù)量為3w左右時(shí)，modules數(shù)量為多少結(jié)果較為理想诈茧？怎么評價(jià)聚類效果的好壞产喉？
答：modules數(shù)量沒有標(biāo)準(zhǔn)，modules數(shù)量無法評估模塊分的好壞敢会，分組是否合理應(yīng)該看樹的樹形圖曾沈，比如樹的分支很清晰就說明模塊式清晰的。modules數(shù)量數(shù)由生物性狀決定的鸥昏。比如樣本表達(dá)信息很豐富的時(shí)候晦譬，modules數(shù)量會很多；如果樣本的基因表達(dá)相對單一互广，modules數(shù)量就會比較少。
問29卧土、我運(yùn)行例子的時(shí)候惫皱，得出來基因之間的direction全是undirected，這和前面的幾種關(guān)系有什么區(qū)別尤莺？
答：WGCNA是一個(gè)undirected的方法旅敷，它的網(wǎng)絡(luò)是無方向的，有相關(guān)關(guān)系但是無方向颤霎。
問30匣沼、如果做有向網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，您推薦那些方法屈嗤？
答：很多方法键思，例如貝葉斯的方法。
問31仔涩、非模式物種可以得出基因之間的相互關(guān)系類型么？得出的結(jié)果也是undirected么？
答：WGCNA是基于表達(dá)兩處理的搁料，所以即使是非模式生物，當(dāng)然也可以他們之間關(guān)系系羞，并且關(guān)系也是一個(gè)無向網(wǎng)絡(luò)郭计。
問32、選擇幾個(gè)表型數(shù)據(jù)進(jìn)行結(jié)合分析比較好
答：越多越好椒振，看實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)昭伸。
問33、感染小鼠澎迎，5個(gè)時(shí)間點(diǎn)庐杨，3個(gè)重復(fù)，找不到合適的表型怎么辦嗡善？
答：如果找不到合適表型辑莫，可以找某個(gè)時(shí)間點(diǎn)應(yīng)答的基因，本身基因的表達(dá)趨勢已經(jīng)有某種生物學(xué)意義的罩引。沒有找到合適表型各吨，也可以看變化趨勢。不一定要做表型的相關(guān)分析袁铐，其他分析也是很有趣的揭蜒。例如，可以對模塊功能的富集分析剔桨，其實(shí)都是可以幫助你找到特定模塊的屉更。所以不用糾結(jié)于做某個(gè)表型的關(guān)聯(lián)分析。
問34洒缀、weight就是tom值嗎瑰谜？
答：是的。
問35树绩、剪模塊是怎么做的萨脑？是根據(jù)TOM劃分嗎？需要自己設(shè)定饺饭，還是R自動的渤早？
答：剪模塊是R中自動完成的，不需要劃分瘫俊，但合并的時(shí)候你可以設(shè)定一個(gè)指標(biāo)鹊杖，比如差異度是0.25悴灵。
問36、看WGCNA說明是用相異矩陣D（D=1-TOM）去做聚類骂蓖，然后動態(tài)剪切积瞒？
答：用TOM值來構(gòu)建矩陣，TOM值就是兩個(gè)樣本的相似度涯竟，1-TOM值就是兩個(gè)樣本的差異度赡鲜，相似度與差異度可以理解為一個(gè)東西，并不矛盾庐船。
問37银酬、模塊特征值和樣本性狀相關(guān)分析的具體方法是？
答：R包用的是計(jì)算相關(guān)系數(shù)的方法筐钟。
問38揩瞪、WGCNA里面一般會提到hubgene，如何確定hubgene?
答：在WGCNA分析里面篓冲，每個(gè)基因都會計(jì)算連通性李破，連通性高的就是hubgene。
問39壹将、在R中安裝“”WGCNA“”說不適合R3.3.1嗤攻，那適合哪個(gè)版本？
答：WGCNA應(yīng)該是所有版本都適合诽俯，如果版本沒有可以考慮降低R軟件的版本妇菱，這個(gè)對分析沒有影響。因?yàn)椴煌琑版本是一樣的暴区。
問40闯团、用STEM分析的時(shí)候擬合多少個(gè)模型合適？
答：建議不要超過20個(gè)仙粱。模塊太多不好分析房交。
參考網(wǎng)站：
http://tiramisutes.github.io/2016/09/14/WGCNA.html
