轉(zhuǎn)座子
轉(zhuǎn)座子(transposable element)：或稱跳躍基因沃饶，是一種可以改變其在基因組中位置的DNA序列胰锌，有時會產(chǎn)生或逆轉(zhuǎn)突變治泥，改變細(xì)胞的遺傳特性和基因組大小暂幼。
轉(zhuǎn)座子按照轉(zhuǎn)座方式的不同筏勒，可分為兩大類：I型轉(zhuǎn)座子(Class I elements)，II型轉(zhuǎn)座子(Class II elements)旺嬉。
I型轉(zhuǎn)座子又叫反轉(zhuǎn)座子(retrotransposon)管行，其在轉(zhuǎn)座時，會先以DNA為模板鹰服，在RNA聚合酶II的作用下病瞳，轉(zhuǎn)錄成一段mRNA，然后再以這段mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA悲酷，最后在整合酶的作用下將這段cDNA整合到基因組上新的位置套菜。根據(jù)反轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座機(jī)制，人們形象地稱其為“復(fù)制-粘貼”型轉(zhuǎn)座原件设易。
II型轉(zhuǎn)座子也叫做轉(zhuǎn)座子(transposon)逗柴，在轉(zhuǎn)座酶的作用下，II型轉(zhuǎn)座子從原來的位置解離下來顿肺，再重新整合到染色體上的其他位置戏溺，原來的位置由于轉(zhuǎn)座子解離形成的斷鏈渣蜗，會在DNA修復(fù)的機(jī)制下被修復(fù)完整。故II型轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座的機(jī)制被形象地稱為“剪切-粘貼”旷祸。
根據(jù)參考文獻(xiàn)對轉(zhuǎn)座子的分類耕拷，總結(jié)如下：
1. LTR 與重復(fù)序列、轉(zhuǎn)座子的關(guān)系LTR-RTs 是 Long terminal repeat-retrotransposons 的縮寫托享，中文名是長末端重復(fù)反轉(zhuǎn)座子骚烧。LTR-RTs 名字中既有重復(fù)、又有轉(zhuǎn)座子闰围，那么它和重復(fù)序列赃绊、轉(zhuǎn)座子是什么關(guān)系呢？
重復(fù)序列：根據(jù)重復(fù)區(qū)域是否連續(xù)可分為串聯(lián)重復(fù)序列和散在重復(fù)序列（又名轉(zhuǎn)座子羡榴、轉(zhuǎn)座元件）兩大類碧查，前者相連，后者不相連校仑。
轉(zhuǎn)座元件(transposable elements, TEs) 又稱轉(zhuǎn)座子：指在基因組中能夠移動或復(fù)制忠售，并可以整合到基因組新位點(diǎn)的一段 DNA 序列。根據(jù)轉(zhuǎn)座過程是否形成 RNA 中間體肤视，轉(zhuǎn)座子可分為 DNA 轉(zhuǎn)座子和反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子档痪。反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是以 RNA 為媒介涉枫，伴有反轉(zhuǎn)錄過程邢滑，以復(fù)制-粘貼的方式在基因組的新位置產(chǎn)生一個新的拷貝。DNA 轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座機(jī)制則是剪切-粘貼的形式愿汰。
LTR-RTs :是反轉(zhuǎn)座子中的一種困后，因其兩側(cè)存在長的末端重復(fù)而得名。不含長末端重復(fù)的反轉(zhuǎn)座子統(tǒng)稱 non-LTR-RTs衬廷，主要包含短散在重復(fù)(SINE)和長散在重復(fù)(LINE)摇予。
2. LTR的分類
動植物基因組中存在大量轉(zhuǎn)座子，尤其是植物基因組中吗跋。LTR ?因其數(shù)量多且 LTR 長度巨大侧戴，在植物轉(zhuǎn)座子中具有較高的基因組含量。在玉米基因組中 LTR 占基因組含量高達(dá) 75% 跌宛，山蒼子基因組中 LTR 占比高達(dá) 47%酗宋，所以基因組 LTR 的鑒定尤為重要。反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子根據(jù)轉(zhuǎn)座元件結(jié)構(gòu)的完整性和轉(zhuǎn)座特點(diǎn)可分為自主元件（編碼轉(zhuǎn)座酶）和非自主元件（自身不編碼轉(zhuǎn)座酶）疆拘。非自主轉(zhuǎn)座元件需在自主元件的協(xié)助下才能發(fā)生轉(zhuǎn)座蜕猫。完整的 LTR-RTs 由兩端序列完全一致的末端重復(fù)、GAG（衣殼蛋白）和 POL 構(gòu)成哎迄，后生動物中含 ENV （包膜蛋白）回右。其中 POL 包含 AP（天冬氨酸酶）隆圆、INT（整合酶）、 RT（逆轉(zhuǎn)錄酶）和 RH（核糖核酸酶 H）翔烁，是 LTR 能否自主轉(zhuǎn)座的關(guān)鍵蛋白渺氧。LTR 分類見圖 2，在高等植物中主要主要包括 Ty1/Copia和 Ty3/Gypsy 兩個超家族蹬屹，二者差別在于 INT 的位置不同阶女。
3. LTR的生物學(xué)意義
不少研究表明活性 LTR 插入到關(guān)鍵基因內(nèi)或周邊會導(dǎo)致性狀改變。2019 年哩治，發(fā)表在 Nature Communications 的《A high-quality apple genome assembly reveals the association of a retrotransposon and red fruit colour》文章中揭示蘋果紅皮表型形成與一個 LTR-RT 插入相關(guān)秃踩。MdMYB1 有 MdMYB11-1、MdMYB1-2 和 MdMYB1-3 三個等位基因业筏，其中 MdMYB1-1 是控制蘋果果皮花青素合成的單一顯性基因憔杨。相較于黃蘋果基因組，在紅蘋果基因組的 MdMYB1-1 基因啟動子上游有一個 LTR-RT（命名為 redTE）插入蒜胖，并經(jīng)過 PCR 驗(yàn)證是紅蘋果中存在一段特異的序列（圖 3）风题。redTE 作為一種增強(qiáng)子谷遂，增強(qiáng) MdMYB1-1 對光的敏感性，從而累計(jì)花青素，形成紅色表皮龟梦。
此外，LTR?的擴(kuò)張和收縮也影響著基因組大小菊卷，文章小葉茶文獻(xiàn)《Mol Plant 項(xiàng)目文章 | 第一個茶樹染色體級別高質(zhì)量參考基因組發(fā)布》中囱淋，揭示小葉茶基因組中 LTR 的擴(kuò)張尤其是非自主 LTR 的擴(kuò)張是小葉茶基因組龐大的主要原因。
4. LTR-RTs 的結(jié)構(gòu)特征
典型的 LTR-RTs 的結(jié)構(gòu)有 5 個特征樊拓，其模式圖見 4-1纠亚，各特征意義如下：
(1) TSR（TSD）: 目標(biāo)重復(fù)位點(diǎn)，是 4~6bp 的短的重復(fù)序列筋夏，在 5’LTR and 3’LTR 兩側(cè)蒂胞，是轉(zhuǎn)座子插入的信號。
(2) 5’LTR and 3’LTR : ?LTR 兩端序列完全一致的末端重復(fù)条篷， TG..CA box骗随，完整的 LTR 均含有此結(jié)構(gòu)。LTR 長度一般在 85~5000bp赴叹。
(3) PBS(primer binding site) 引物結(jié)合位點(diǎn): 在 5’LTR 的末端鸿染，可與一些 tRNA 3’ 末端互補(bǔ)結(jié)合的一段 18bp 左右的序列，是反轉(zhuǎn)錄的第一步稚瘾。
(4)?蛋白區(qū)域: 長度通常在 1000~15000bp牡昆。
GAG：衣殼蛋白。
POL：包含4中酶，由AP（天冬氨酸酶）丢烘、IN（INT,整合酶）柱宦、RT（逆轉(zhuǎn)錄酶）、RH（核糖核酸酶）播瞳，LTR 能否自主轉(zhuǎn)座的關(guān)鍵原因掸刊。
ENV：包膜蛋白，后生動物中存在赢乓。
(5) PPT：3’LTR 的起始位置短的富含嘌呤的序列忧侧，11~15bp。
LTR 在生物體內(nèi)歷經(jīng)成千上萬年的進(jìn)化牌芋，發(fā)展出許多存在形式（圖 4-2）蚓炬。我們通常將包含兩個相對完整的 LTRs 和已識別的 PPT 和 PBS 位點(diǎn)的元素，且兩側(cè)有 TSD 的 LTR 定義為 Intact LTR（A）躺屁。由于 LTR-RTs 兩端序列非常相似肯夏，LTR-RTs 內(nèi)可發(fā)生重組，導(dǎo)致內(nèi)部元件消失犀暑，形成 solo LTR（C）驯击，而 solo LTR 的數(shù)量表明了一個基因組中 LTR 去除的頻率和效率。此外 LTR 發(fā)生缺失耐亏、易位可形成截?cái)嗟?LTR（B）徊都。LTR 也會經(jīng)常插入到其他 LTR 內(nèi)部區(qū)域，形成嵌套 LTR（D）广辰。因存在這些突變機(jī)制暇矫，實(shí)際上完整的 LTR-RTs （A）只占基因組中所有 LTR-RT 相關(guān)序列的一小部分。
5. LTR-RTs 鑒定方法
LTR-RT 的鑒定方法基本歸于三類：從頭預(yù)測轨域、基于結(jié)構(gòu)預(yù)測袱耽、基于同源比對杀餐。LTR_STRUC[5]?是一款最早的從頭預(yù)測 LTR 的軟件干发，LTR_finder[3]?和 LTRharvest[6]?是目前為止鑒定 LTR 最敏感的程序，但假陽性依然很高史翘。RepeatMasker[7]?基于數(shù)據(jù)庫枉长，使用同源方法來預(yù)測 LTR，但不同物種 LTR 差異較大琼讽，構(gòu)建物種特有的 LTR 庫非常必要必峰。在 2017 年密歇根州立大學(xué)園藝系的 Shujun Ou 團(tuán)隊(duì)開發(fā) LTR_retriever[4]?平臺用于 LTR 的鑒定，文章發(fā)表在 Plant Physiology 上钻蹬。這是一款整合軟件吼蚁，以一個或多個 LTR 預(yù)測軟件鑒定 LTR 的結(jié)果作為輸入文件，通過不同模塊（圖 5-1）對 LTR 進(jìn)行過濾和修正來對預(yù)測軟件的預(yù)測結(jié)果進(jìn)行整合和調(diào)整，以得到非冗余精準(zhǔn)且完整的物種特異 LTR 庫肝匆，再使用 RepeatMasker[7]?進(jìn)行預(yù)測
LTR_retriever 軟件從 sensitivity（敏感性）粒蜈、specificity（特異性）、accuracy（準(zhǔn)確性）旗国、precision（精確度）四個維度對 LTR 鑒定結(jié)果進(jìn)行評估枯怖，其具體意義見圖 5-2。以真實(shí) LTR 和非 LTR 序列作為參考庫能曾，使用軟件進(jìn)行預(yù)測度硝。對預(yù)測結(jié)果分為以下四類：
TP：真陽性，真實(shí)的 LTR寿冕，被準(zhǔn)確預(yù)測出
FN：假陰性 蕊程，真實(shí)的 LTR，未被準(zhǔn)確預(yù)測出
TN：真陰性 驼唱，非 LTR 序列未被預(yù)測當(dāng)成 LTR
FP：假陰性存捺，非 LTR 序列被當(dāng)成 LTR
從下圖公式可知敏感性代表對真正 LTR 的檢出能力，特異性代表排除非 LTR 序列的能力曙蒸，精確性代表正確檢出的能力捌治，精確度代表檢出結(jié)果的真陽性率，精確度越高則表明結(jié)果越可靠纽窟。
使用 LTR_retriever 對現(xiàn)有軟件預(yù)測 LTR 結(jié)果進(jìn)行肖油，評估結(jié)果（圖 5-3）顯示 LTR_retriever 明顯優(yōu)于其他現(xiàn)有軟件，而 Shujun Ou 團(tuán)隊(duì)在 2019 發(fā)表在 Genome Biology 上的有關(guān)轉(zhuǎn)座子注釋方法中推薦 LTR 的鑒定方法是使用以 LTR_finder 和 LTRharvest 軟件鑒定結(jié)果作為 LTR_retriever 的輸入文件[8]臂港。
6. 諾禾致源為您定制專屬 LTR 分析方案
隨著三代測序技術(shù)的發(fā)展森枪，借助于超長度長序列，重復(fù)序列的組裝將會越來越精確审孽。人們對重復(fù)序列的研究會更加深入县袱，而 LTR 因其特殊的生物學(xué)意義被格外關(guān)注。LTR 的鑒定是 LTR 相關(guān)分析的基礎(chǔ)佑力，目前 LTR 分析方法尚無標(biāo)準(zhǔn)式散。表 6-1 是諾禾致源公司聯(lián)合發(fā)表的 LTR 分析相關(guān)文章列表。諾禾致源 LTR 分析流程中打颤，先使用 LTR_finder 和 LTRharvest 對 LTR 進(jìn)行鑒定暴拄，再利用 LTR_retriever 進(jìn)行整合，構(gòu)建非冗余精準(zhǔn)的物種特異 LTR 數(shù)據(jù)庫后使用同源預(yù)測方法進(jìn)行注釋编饺，再過濾掉假陽性乖篷，為您注釋出全面且精確的物種 LTR 序列，包括 intact LTR透且、solo LTR撕蔼、LTR 相關(guān)序列，非典型 LTR 等。明確 LTR 含量在基因組中的占比鲸沮，在染色體上的分布情況（圖 6-1）畅形。
根據(jù)物種 LTR 蛋白結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫，對 LTR-RT 進(jìn)行結(jié)構(gòu)注釋和家族鑒定诉探。LTR 分析很多日熬，可根據(jù)物種 LTR 鑒定結(jié)果、生物學(xué)意義進(jìn)行特殊分析肾胯，例如通過聚類分析竖席，確定基因組中主要的 LTR 屬于何種家族（圖 6-2）；對 LTR 進(jìn)行插入時間評估分析敬肚，探索 LTR 的進(jìn)化動態(tài)（圖 6-3）毕荐；構(gòu)建特殊家族進(jìn)化樹，研究某類 LTR 的進(jìn)化等艳馒。此外憎亚，轉(zhuǎn)座子誘導(dǎo)的表觀遺傳變化經(jīng)常影響相鄰基因的差異表達(dá)并產(chǎn)生新的調(diào)控模式，例如前面所提的蘋果表皮顏色性狀文獻(xiàn)中檢測到紅蘋果 redTE 序列中有幾個區(qū)域明顯高度甲基化弄慰，這為 LTR 分析提供新的思路第美。
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