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自從二代測(cè)序技術(shù)出現(xiàn)，把一次實(shí)驗(yàn)測(cè)許多條DNA序列的這個(gè)難題解決之后敢伸，一次把一個(gè)人的全基因組給測(cè)出來(lái)遇骑，最極限的情況，就是樣本量就是少到一個(gè)細(xì)胞羡藐，就要測(cè)出整個(gè)基因組的序列信息贩毕。

三個(gè)難題

要實(shí)現(xiàn)從一個(gè)細(xì)胞樣本測(cè)出全基因組的DNA序列，至少要克服以下3個(gè)難題：

• 第1個(gè)難題传睹，就是如何實(shí)現(xiàn)均勻擴(kuò)增耳幢，用傳統(tǒng)的隨機(jī)引物PCR的方法來(lái)擴(kuò)增不同擴(kuò)增片段的擴(kuò)增效率多少會(huì)有一些差異岸晦，這些擴(kuò)增效率的差異會(huì)隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加欧啤，呈現(xiàn)出指數(shù)放大的效果。其結(jié)果就是會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的覆蓋不均一启上，極少數(shù)區(qū)段的DNA被大量擴(kuò)增邢隧，測(cè)序后它深度非常深，但在大多數(shù)區(qū)段只有很低的覆蓋冈在，甚至沒(méi)有覆蓋倒慧。那么我們就無(wú)法有效地判斷那些低擴(kuò)增效率區(qū)段的基因序列的情況。

• 第2個(gè)難題包券，就是 全基因組覆蓋問(wèn)題纫谅。常規(guī)的、用大量DNA進(jìn)行建庫(kù)的方法溅固，因?yàn)榇驍喔讹酢⒀a(bǔ)平、加A侍郭、加接頭等一長(zhǎng)串的操作询吴，每一步都會(huì)有DNA片段的損失。結(jié)果就是初始DNA中很大一部分會(huì)被浪費(fèi)掉亮元，而沒(méi)有形成有效的文庫(kù)分子猛计。

在單細(xì)胞測(cè)序中，丟失大部分的起始DNA爆捞，是不可接受的奉瘤。單細(xì)胞測(cè)序要求幾乎所有的原始基因組片段都得到擴(kuò)增，并且在后續(xù)的測(cè)序過(guò)程中被測(cè)序測(cè)到煮甥。這就要求幾乎所有的片段毛好，都會(huì)被得到擴(kuò)增望艺，而不只是少數(shù)片段得到有效擴(kuò)增。

• 第3個(gè)難題肌访，是這種方法要有較高的擴(kuò)增效率找默。建好的文庫(kù)，在HiSeq測(cè)序儀上機(jī)的時(shí)侯吼驶，大約每上機(jī)2萬(wàn)個(gè)文庫(kù)分子惩激，只有1個(gè)文庫(kù)分子，是能夠在測(cè)序的Flowcell表面生成簇蟹演，并且被測(cè)序測(cè)到的风钻，剩下的大多數(shù)文庫(kù)分子，在上機(jī)的時(shí)侯是被水沖走的酒请。所以骡技，單細(xì)胞基因組擴(kuò)增的方法，還要有較高的擴(kuò)增效率羞反。至少要有上萬(wàn)倍到幾十萬(wàn)倍的擴(kuò)增效率布朦，才能保證在全基因組測(cè)序的時(shí)侯，大部分的片段都被測(cè)序測(cè)到昼窗。

兩種方法

為了解決上述的難題是趴，科學(xué)家想了許多的辦法。到目前為止澄惊，大家比較認(rèn)可的方法有兩種：第一種是MALBAC方法唆途。第二種是MDA方法。

- MALBAC方法

我們先來(lái)說(shuō)這個(gè)MALBAC方法掸驱。它的全稱是：MultipleAnnealing and Looping-Based Amplification Cycles肛搬。是謝曉亮教授發(fā)明的方法

這張圖是MALBAC方法的示意圖。這個(gè)黑色的線條毕贼，就是基因組模板DNA温赔，這些紅顏色的線條就是擴(kuò)增引物，擴(kuò)增引物的5’端有27個(gè)堿基的通用序列帅刀，這些通用序列會(huì)作為未來(lái)的PCR通用擴(kuò)增引物的結(jié)合序列让腹。擴(kuò)增引物的3’端有8個(gè)隨機(jī)序列的堿基，這8個(gè)堿基可以隨機(jī)地雜交到基因組DNA的互補(bǔ)序列上扣溺。

這些灰色的橢園是Phi 29 DNA聚合酶骇窍，Phi 29 DNA聚合酶有一個(gè)特點(diǎn)，它不僅可以生成新的DNA鏈锥余，它還能把之前已經(jīng)合成好的DNA鏈給解鏈開腹纳。

再形成自己的新鏈，這個(gè)特點(diǎn)能夠把每個(gè)循環(huán)所能合成的DNA新鏈的數(shù)量提高幾倍、甚至幾十倍嘲恍、上百倍足画。接下來(lái)，就是做5個(gè)MALBAC循環(huán)佃牛，請(qǐng)注意淹辞，這里每個(gè)循環(huán)的最后一步是58度退火。我們后面要詳細(xì)解釋這一步58度退火的作用俘侠。

第一個(gè)循環(huán)下來(lái)象缀，得到的是一批5’端有通用擴(kuò)增序列的DNA片段。

在第二個(gè)循環(huán)完成后爷速，所產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物中央星，大部分是5’端有通用序列。而3’端惫东，有與通用序列互補(bǔ)的序列的這些片段莉给。

圖中的這4個(gè)步驟，一共重復(fù)5次廉沮，這樣做的巧妙之處颓遏，就是要解決我們剛才所說(shuō)的3個(gè)難題。

第一废封、是要均勻擴(kuò)增
第二州泊、是要全基因組覆蓋
第三丧蘸、是要有高的擴(kuò)增效率

這個(gè)MALBAC方法的巧妙之處漂洋，就是在每個(gè)循環(huán)的最后，加了一步58度退火力喷，這一退火過(guò)程刽漂，它讓完整擴(kuò)增的產(chǎn)物，它的兩端發(fā)生鏈內(nèi)雜交弟孟。這樣贝咙，3’端的序列就不能與新的、游離的引物發(fā)生雜交拂募。這也就不會(huì)引新的庭猩、發(fā)起始于3’端的擴(kuò)增，這樣陈症，就避免了完整擴(kuò)整的產(chǎn)物的自我指數(shù)擴(kuò)增蔼水。

現(xiàn)在，還是8個(gè)隨機(jī)序列的引物在模板上隨機(jī)地找結(jié)合位置录肯，所有的位點(diǎn)都有一樣的機(jī)會(huì)被擴(kuò)增趴腋。那么，這樣實(shí)際得到的產(chǎn)物分2種：

• 第1種，就是m* n 個(gè)“完整擴(kuò)增產(chǎn)物”优炬，這是最主要的產(chǎn)物颁井。這里“m”就是循環(huán)的次數(shù)， “n”是一個(gè)循環(huán)中蠢护，有多少個(gè)擴(kuò)增雅宾，引物可以粘到一個(gè)模板上。

• 第2種擴(kuò)增產(chǎn)物葵硕，就是(m+1)* n個(gè)“半擴(kuò)增產(chǎn)物”秀又，第3種DNA，就是那個(gè)原始的DNA模板贬芥，這里完整產(chǎn)物的數(shù)量是“m*n ”吐辙，也就是說(shuō)，擴(kuò)增產(chǎn)物（的數(shù)量）與擴(kuò)增的循環(huán)次數(shù)“m”成正比蘸劈，而不是與m的平方成正比昏苏。更不是與2 的M次方成正比。

這也就是達(dá)到了威沫，我們想要的“線性擴(kuò)增”的目的贤惯。也就是說(shuō)擴(kuò)增產(chǎn)物（的數(shù)量）與擴(kuò)增的次數(shù)成線性關(guān)系。這就達(dá)成了我們單細(xì)胞測(cè)序當(dāng)中第1個(gè)要求“線性擴(kuò)增”棒掠。

再利用Phi 29聚合酶的能一次在模板上聚合出多個(gè)新鏈的功能來(lái)解決“全基因組覆蓋”孵构。

在5輪的擴(kuò)增之后，每個(gè)模板都會(huì)有5*n^2個(gè)擴(kuò)增片段烟很。這樣颈墅，就可以保證建庫(kù)時(shí)大多數(shù)的基因組區(qū)域可以被建成文庫(kù)，最后雾袱，可以被（測(cè)序）測(cè)到恤筛。

第3個(gè)要解決“高效率擴(kuò)增”。還是利用了這個(gè)Phi 29酶的一次得到多個(gè)擴(kuò)增片段的這個(gè)效果芹橡，來(lái)達(dá)成的毒坛。

上面所說(shuō)的，就是MALBAC單細(xì)胞擴(kuò)增技術(shù)的基本原理林说、和它的巧妙之處.

- MDA方法

目前市場(chǎng)上還有一種單細(xì)胞的擴(kuò)增技術(shù)煎殷，叫MDA擴(kuò)增技術(shù)。它的全稱是MultipleDisplacement Amplification腿箩。MDA方法的技術(shù)核心是用Phi 29 DNA聚合酶來(lái)進(jìn)行直接的擴(kuò)增豪直。

Phi 29酶的特點(diǎn)是，它可以把雙鏈DNA進(jìn)行解鏈度秘，然后顶伞，在常溫條件下饵撑，就把原始模板進(jìn)行大量擴(kuò)增。

- 兩種方法的比較

把MDA和MALBAC兩種方法進(jìn)行比較

MDA的優(yōu)勢(shì)在于唆貌，它的擴(kuò)增效率更高滑潘，并且，實(shí)驗(yàn)方法更簡(jiǎn)單锨咙。

MALBAC方法的特點(diǎn)语卤，在于它的擴(kuò)增均一性更好。但是酪刀，它得到的擴(kuò)增DNA量相對(duì)較少粹舵，或者說(shuō)，它的擴(kuò)增效率相對(duì)比較低骂倘。

這張圖是：大量細(xì)胞測(cè)序眼滤、MDA方法測(cè)序、MALBAC方法測(cè)序历涝，這三種測(cè)序結(jié)果的Lorenz曲線诅需。Lorenz曲線是越接近于對(duì)角線，則覆蓋越均一荧库，從圖中堰塌，我們可以看出大量細(xì)胞測(cè)序，它的均一性是最好的分衫。用MALBAC方法測(cè)序场刑，它的均一性比大量細(xì)胞測(cè)序的均一性要差一些，但是要比MDA的方法的均一度要好蚪战。

這張圖是用三種方法來(lái)測(cè)腫瘤細(xì)胞中的拷貝數(shù)變異牵现。其中橫軸是染色體的序列，縱軸是測(cè)序的覆蓋深度屎勘，可以明顯地看到施籍，在大量細(xì)胞測(cè)序的結(jié)果中居扒，可以非常直觀地看到拷貝數(shù)變異的情況概漱。

而用MALBAC的方法，也還是能夠比較清楚地看到拷貝數(shù)變異喜喂。但是瓤摧，它沒(méi)有大量細(xì)胞測(cè)序的結(jié)果那么清楚。而用MDA的方法來(lái)看拷貝數(shù)變異玉吁，則不是那么容易看清楚照弥。

- 臨床應(yīng)用

單細(xì)胞測(cè)序，有著廣泛的應(yīng)用前景进副。目前最主要2個(gè)應(yīng)用：

• 1.是在胚胎植入前進(jìn)行基因拷貝數(shù)變異檢測(cè)这揣。

• 2.是進(jìn)行腫瘤的染色體變異研究悔常。

在這里我們介紹一下，單細(xì)胞測(cè)序在胚胎植入前檢測(cè)中的應(yīng)用给赞，在有習(xí)慣性流產(chǎn)的夫婦當(dāng)中机打，最常見的病因就是染色體的平衡易位，所謂染色體平衡易位片迅，也就是A染色體残邀，的一段移到了B染色體上。

如果夫妻一方有染色體平衡易位柑蛇，那么這對(duì)夫婦的受精卵中芥挣，每4個(gè)受精卵，可能只有1個(gè)是正常的耻台。剩下3個(gè)（不正常的受精卵）空免，很可能會(huì)流產(chǎn)。要把這一個(gè)正常的受精卵挑出來(lái)盆耽，目前鼓蜒，最有效的解決手段是做受精卵植入前檢測(cè)。

那么具體的操作方法征字，就是先做人工受精都弹。在受精卵發(fā)育到8個(gè)細(xì)胞的時(shí)侯，通過(guò)顯微操作匙姜，抓一個(gè)細(xì)胞出來(lái)進(jìn)行測(cè)序畅厢。在這個(gè)測(cè)序過(guò)程當(dāng)中，就要用到MDA方法或MALBAC方法進(jìn)行擴(kuò)增氮昧、建庫(kù)框杜、測(cè)序。然后測(cè)序完成之后袖肥，挑出那個(gè)好的受精卵咪辱，植回到母親的子宮中去。長(zhǎng)成一個(gè)正常的新生兒椎组。這個(gè)油狂，就是受精卵植入前基因檢測(cè)。這項(xiàng)技術(shù)寸癌，是對(duì)生殖健康有很大幫助的一項(xiàng)新技術(shù)专筷。

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