ARMS-PCR
擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)PCR （Amplification Refractory Mutation System PCR，ARMS-PCR）楷扬，又稱為等位基因特異性PCR（Allele-Specific PCR，AS-PCR）唧取。
ARMS-PCR技術(shù)建立在等位基因特異性延伸反應(yīng)基礎(chǔ)上键科，只有當(dāng)某個(gè)等位基因特異性引物的3’末端堿基與突變位點(diǎn)處堿基互補(bǔ)時(shí)浇衬，才能進(jìn)行延伸反應(yīng)。常規(guī)PCR擴(kuò)增DNA所用的上十兢、下游引物與靶序列完全匹配趣竣，而等位基因PCR采用等位基因特異的兩條上游引物，兩者在3’端核苷酸不同旱物，一個(gè)對野生型等位基因特異遥缕，另一個(gè)對突變型等位基因特異，在Taq DNA聚合酶作用下宵呛，與模板不完全匹配的上游引物將不能退火单匣，不能生成PCR產(chǎn)物，而與模板匹配的引物體系則可擴(kuò)增出產(chǎn)物烤蜕，通過凝膠電泳或者qPCR就能很容易地分辨出擴(kuò)增產(chǎn)物的有無封孙，從而確定SNP基因型，目前市場主流為ARMS+qPCR技術(shù)讽营，采用TaqMan探針進(jìn)行檢測虎忌。（比如腫瘤靶向用藥EGFR基因檢測，CFDA批準(zhǔn)的檢測試劑盒橱鹏，90%以上都是ARMS檢測方法）簡而言之：引物3’端錯(cuò)配的堿基會導(dǎo)致PCR引物延伸速度變慢膜蠢，當(dāng)錯(cuò)配達(dá)到一定程度時(shí)，引物延伸將終止莉兰，得不到特異長度的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物挑围，從而提示模板DNA沒有與引物3’端配對的堿基，反之則有糖荒。
橫向?yàn)獒槍和M的兩條上游引物杉辙，縱向?yàn)閃和M的DNA Template，可以看出W引物只能特異性擴(kuò)增W模板捶朵，M引物只能特異性擴(kuò)增M模板蜘矢。（在此基礎(chǔ)上又延伸出四引物ARMS-PCR技術(shù)（Tetra-Primer ARMS-PCR）：同時(shí)使用4條PCR引物，兩條3’末端位于SNP位點(diǎn)上的分屬不同基因型的方向相反的內(nèi)引物（inner Primer）综看，兩條位于SNP外側(cè)并與SNP距離不等的外引物（outer Primer）品腹，4條引物理論上如果都匹配的話，兩兩組合可擴(kuò)增出3條DNA產(chǎn)物（位于同一位點(diǎn)的兩內(nèi)引物無法產(chǎn)生長片段擴(kuò)增產(chǎn)物红碑，多為引物二聚體）舞吭。但若其中一條針對SNP的內(nèi)引物不匹配，則只能擴(kuò)增出另外兩條DNA片段。由于外引物到達(dá)SNP距離不同羡鸥，擴(kuò)增產(chǎn)物大小也就不同蔑穴，通過電影根據(jù)局?jǐn)U增產(chǎn)物的大小即可判斷基因型，同時(shí)由外側(cè)引物擴(kuò)增的長片段產(chǎn)物可作為體系的陽性質(zhì)控）
ARMS+TaqMan qPCR
理論上Taq DNA聚合酶必須在引物3’末端堿基與模板完全互補(bǔ)情況下才能進(jìn)行有效的聚合反應(yīng)兄春，但由于Taq DNA嚴(yán)謹(jǐn)性受多因素影響澎剥，某些情況下，即使引物的3’末端堿基與模板不互補(bǔ)赶舆，延伸仍然可以進(jìn)行（如果3′末端只有一個(gè)堿基的錯(cuò)配哑姚，那么是引物是可以錯(cuò)配結(jié)合的并可以進(jìn)行延伸的，只是延伸的效率低于那些3′末端正好配對的引物）芜茵，而且不同的3’末端錯(cuò)位（mismatch）有不同的延伸效率（如果在3′末端引入了其他的錯(cuò)配堿基叙量，那么錯(cuò)配的數(shù)目太多或達(dá)到一定程度，那么3′末端無法進(jìn)行延伸）九串，因而僅靠引物3’末端一個(gè)堿基的錯(cuò)配不能充分而可靠地區(qū)分兩個(gè)等位基因绞佩，進(jìn)而造成假陽性結(jié)果。
為了提高引物延伸的特異性猪钮，可在3’端倒數(shù)第2位或第3位堿基處引入一個(gè)錯(cuò)配堿基品山，該錯(cuò)配堿基與3’末端的錯(cuò)配堿基共同作用，使引物在與其3’末端不互補(bǔ)的模板中擴(kuò)增產(chǎn)物率顯著降低烤低，而引物在與其3’末端互補(bǔ)的模板中正常擴(kuò)增肘交，引物的錯(cuò)配堿基類型取決于3’末端堿基錯(cuò)配類型。
注意：當(dāng)3’末端是“強(qiáng)”錯(cuò)配（A/G或G/T）時(shí)扑馁，可以在引物中引入一個(gè)“弱”錯(cuò)配（C/A或C/T）涯呻；當(dāng)3’末端是“弱”錯(cuò)配時(shí)，則需要在引物中引入一個(gè)“強(qiáng)錯(cuò)配”腻要；當(dāng)3’末端是出“中度”錯(cuò)配（A/A复罐、C/C、G/G雄家、T/T）時(shí)效诅，可以在引物中再引入一個(gè)“中度”錯(cuò)配。一般在3’末端引入突變（倒數(shù)第3個(gè)堿基）趟济，可以顯著提高特異性
ARMS的特異性引物設(shè)計(jì)完成后乱投，還需要一對等位基因特異性TaqMan探針，TaqMan探針5’端為熒光基團(tuán)咙好，3’端連有通用的熒光淬滅基團(tuán)篡腌。在靶基因擴(kuò)增過程中褐荷，PCR引物和熒光標(biāo)記探針在退火時(shí)均會與目標(biāo)序列互補(bǔ)結(jié)合（Probe Tm比較高勾效，需在Primer 之前與DNA Template 結(jié)合）。Taq 酶在延伸模板鏈延伸時(shí)遇到與模板穩(wěn)定結(jié)合的探針，Taq酶的5’-3’外切核酸酶會將與模板結(jié)合的特異性探針降解层宫，從而使探針上的熒光基團(tuán)因?yàn)槲锢砜臻g分離杨伙，淬滅效應(yīng)消失，發(fā)出熒光萌腿。如果熒光探針與目標(biāo)序列存在錯(cuò)配限匣，就會大大減少熒光的釋放量。后續(xù)通過軟件分析處理熒光數(shù)據(jù)而確定基因型毁菱。
TaqMan-MGB探針技術(shù)是在TaqMan法基礎(chǔ)上優(yōu)化而成的一個(gè)SNP檢測方法（由普通Taqman探針和MGB基團(tuán)兩部分組成）米死，該探針的3’端結(jié)合了小溝結(jié)合物（minor groove binder，MGB）贮庞，MGB與DNA螺旋的小溝（minor groove）契合峦筒，通過穩(wěn)定DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)來提高雜交的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。這使得探針長度進(jìn)一步縮短窗慎，Tm值較高物喷，增加了探針的雜交穩(wěn)定性，使結(jié)果更準(zhǔn)確遮斥。該探針結(jié)合的為非熒光淬滅基因峦失，這可大大降低熒光本底，提高反應(yīng)靈敏度术吗。MGB探針設(shè)計(jì)應(yīng)使SNP位點(diǎn)處于探針中間1/3范圍內(nèi)尉辑，盡量縮短MGB探針長度，但不少于13個(gè)堿基
ARMS-PCR優(yōu)缺點(diǎn)
- 優(yōu)點(diǎn)：
- 操作簡單藐翎；
- 時(shí)間快速材蹬；
- 靈敏度高，可檢測低至1%的突變吝镣；
- 只有一次開蓋過程堤器，有效防止污染；
- 整個(gè)操作只需Real-time PCR儀末贾；
- 有大量成熟的商品化試劑盒提供闸溃；
- 成本較低（LDT）。
- 缺點(diǎn)：
- 通量較低拱撵；
- 不能檢測未知突變辉川；
- 不適于位點(diǎn)附近GC含量過高或過低的SNP的分型檢測。
參考
1.基因Talks公眾號：
