細(xì)胞轉(zhuǎn)染對(duì)初接觸細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的科研人員而言筹吐，是一道難過的坎兒痘儡，細(xì)胞轉(zhuǎn)染率低的話刊咳，你珍貴的細(xì)胞可能就只能扔掉了彪见。

大家都知道，細(xì)胞是由帶負(fù)電荷的磷脂雙分子層構(gòu)成娱挨，這對(duì)大分子物質(zhì)來說是個(gè)不可透過的屏障余指，比如DNA和RNA的磷酸骨架，為了使核酸穿過細(xì)胞膜跷坝，開發(fā)了多種技術(shù)酵镜，大致可分為物理介導(dǎo)、化學(xué)介導(dǎo)和生物介導(dǎo)柴钻。

幾種常見的轉(zhuǎn)染方法：

1淮韭、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法

陽離子脂質(zhì)體表面帶正電荷，能與核酸的磷酸根通過靜電作用贴届，將DNA分子包裹入內(nèi)靠粪，形成DNA脂復(fù)合物，也能被表面帶負(fù)電的細(xì)胞膜吸附毫蚓，再通過融合或細(xì)胞內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞占键。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中，是目前實(shí)驗(yàn)室最方便的轉(zhuǎn)染方法之一绍些，其轉(zhuǎn)染率較高捞慌，優(yōu)于磷酸鈣法。

2柬批、磷酸鈣共沉淀法

該方法可重復(fù)性差啸澡，而且磷酸鈣溶液對(duì)溫度袖订、pH和緩沖鹽濃度的變化十分敏感，對(duì)細(xì)胞尤其是原代細(xì)胞毒性較大嗅虏，也不能采用RPMI培養(yǎng)基洛姑，因?yàn)槠浜懈邼舛鹊牧姿猁}。

3皮服、電穿孔轉(zhuǎn)染法

電流能夠可逆地?fù)舸┘?xì)胞膜形成瞬時(shí)的小孔促使DNA分子進(jìn)入胞內(nèi)楞艾，這種方法就是電穿孔。

當(dāng)遇到某些脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率很低或幾乎無法轉(zhuǎn)入時(shí)可以用電穿孔法轉(zhuǎn)染龄广。

一般情況下硫眯，高電場強(qiáng)度會(huì)殺死50%-70% 的細(xì)胞。現(xiàn)在針對(duì)細(xì)胞死亡開發(fā)出了一種電轉(zhuǎn)保護(hù)劑择同，可以大大的降低細(xì)胞的死亡率两入，同時(shí)提高電穿孔轉(zhuǎn)染效率。

4敲才、病毒感染

對(duì)于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染與電穿孔轉(zhuǎn)染都無法成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系可以采用病毒感染裹纳，腺病毒，腺相關(guān)病毒紧武，逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體已廣泛用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞體內(nèi)外的基因轉(zhuǎn)染剃氧，轉(zhuǎn)染效率比較高，適用于較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞阻星。

但是插入的片段長度有一定限制朋鞍，最重要的是技術(shù)難度比較高，在一般實(shí)驗(yàn)室中很難普及妥箕，而且某些病毒起效時(shí)間比較慢番舆，跟不上細(xì)胞這種快速繁殖的速度，如果只是做簡單細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染性價(jià)比不高矾踱。

沒有一種方法適用于所有的細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)恨狈，理想的方法應(yīng)根據(jù)細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行選擇，如果只是在細(xì)胞水平做呛讲，而且用的是簡單細(xì)胞系禾怠，那么脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染是綜合比較起來不錯(cuò)的一個(gè)方法。

所以贝搁，我們主要來探討一下脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染：

進(jìn)行實(shí)驗(yàn)之前吗氏，請(qǐng)先規(guī)劃好你的實(shí)驗(yàn)，一般細(xì)胞轉(zhuǎn)染需要24h-72h雷逆，所以要充分了解細(xì)胞生長速度弦讽，計(jì)算所需脂質(zhì)體和DNA的儲(chǔ)備量，并確認(rèn)有足夠的下列材料：Opti-MEM無血清培養(yǎng)基，Lipofectamine轉(zhuǎn)染試劑往产，以及DNA被碗，這個(gè)一定要確認(rèn)好，否則生氣都沒辦法怪別人仿村。

做好以上準(zhǔn)備后锐朴，具體的操作步驟如下：

　1、細(xì)胞鋪板

(1)一般會(huì)選擇復(fù)蘇細(xì)胞傳代3-4次(匯合率達(dá)到90%之前對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代蔼囊，不要長到100%)焚志，從解凍過程中恢復(fù)過來可以穩(wěn)定生長的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，傳代次數(shù)高(>30-40)時(shí)畏鼓，細(xì)胞的生長速度和形態(tài)會(huì)改變酱酬。

(2)如果提總蛋白，一般選擇六孔板進(jìn)行轉(zhuǎn)染云矫，因?yàn)檗D(zhuǎn)染的細(xì)胞提取蛋白的總量能達(dá)到200ug岳悟，一般夠做并且需要的DNA和Lipofectamine又相對(duì)比較少。

(3)傳代條件取決于所用的細(xì)胞系泼差。對(duì)于快速生長的細(xì)胞，倍增時(shí)間為16小時(shí)(如HEK293)呵俏。對(duì)于生長緩慢的細(xì)胞堆缘，倍增時(shí)間為36小時(shí)(如原代細(xì)胞)。

(4)轉(zhuǎn)染當(dāng)天普碎，將細(xì)胞鋪板吼肥。如果在轉(zhuǎn)染前一天或更早時(shí)間鋪板，轉(zhuǎn)染效率可能下降麻车，如果是簡單細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染缀皱，可以直接在前一天晚上鋪板，第二天來轉(zhuǎn)染动猬。轉(zhuǎn)染時(shí)啤斗，細(xì)胞密度會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率，細(xì)胞密度保持在匯合率為70-90%(這個(gè)前提是轉(zhuǎn)染24h赁咙，如果轉(zhuǎn)染48h則需要匯合率為50-70%)钮莲，細(xì)胞的鋪板和轉(zhuǎn)染也可同時(shí)進(jìn)行。

2彼水、細(xì)胞轉(zhuǎn)染

吸去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基崔拥，用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次。更換無血清培養(yǎng)基凤覆。準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染制備液链瓦，用滅菌后的EP管制備。

以六孔板為例盯桦，A液：用200μl Opti-MEM稀釋4μg質(zhì)粒;B液:用200μl Opti-MEM稀釋10μl lipo2000慈俯，分別將A液渤刃、B液輕輕混勻，靜置5min肥卡，吸取B液加入至A液中溪掀，輕輕混勻，室溫靜置20min步鉴。

加入轉(zhuǎn)染試劑到每個(gè)孔的培養(yǎng)基中揪胃，6h后，更換成完全培養(yǎng)基氛琢，繼續(xù)培養(yǎng)到24-48小時(shí)(不同的質(zhì)粒和脂質(zhì)體最佳搭配比例不同喊递，轉(zhuǎn)染前，應(yīng)該摸一個(gè)最佳配比阳似。質(zhì)粒：脂質(zhì)體=1：1骚勘，1：1.5，1：2撮奏，1：2.5俏讹，1：3，1：3.5的梯度比例來檢測最佳轉(zhuǎn)染比例畜吊，一般質(zhì)粒有帶熒光泽疆，可以通過觀察每組熒光強(qiáng)弱來判斷轉(zhuǎn)染效率)。以下為不同規(guī)格的培養(yǎng)板需要加DNA和lipo2000的量玲献。

轉(zhuǎn)染時(shí)殉疼，應(yīng)使用優(yōu)質(zhì)質(zhì)粒：

1、通過測量OD 值來確定DNA純度和濃度捌年，測得的OD值應(yīng)介于1.7-1.9之間瓢娜。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染基于電荷吸引原理，如果DNA不純礼预，如帶少量的鹽離子眠砾，蛋白，代謝物污染都會(huì)顯著影響轉(zhuǎn)染復(fù)合物的有效形成及轉(zhuǎn)染的進(jìn)行托酸。

2荠藤、含有內(nèi)毒素的質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞有很大的毒性作用。

轉(zhuǎn)染時(shí)获高，小心輕柔的將lipo2000加到培養(yǎng)基中并輕輕混勻哈肖，避免粗暴用力吹打，會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)體失效念秧。

血清一度曾被認(rèn)為會(huì)降低轉(zhuǎn)染效率淤井，老一代的轉(zhuǎn)染方法往往要求轉(zhuǎn)染前后用PBS洗細(xì)胞然后在無血清培養(yǎng)基條件下轉(zhuǎn)染，但有些對(duì)此敏感的細(xì)胞會(huì)受到損傷，甚至死亡(比如貼壁較差的細(xì)胞币狠，在PBS洗滌時(shí)很容易沖刷細(xì)胞)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率極低游两。

不過轉(zhuǎn)染產(chǎn)品配方幾經(jīng)革新后的今天，對(duì)于主流的轉(zhuǎn)染試劑來說漩绵，血清的存在已經(jīng)不會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率贱案，甚至還有助于提高轉(zhuǎn)染效率，但是血清的存在會(huì)影響DNA-轉(zhuǎn)染復(fù)合物的形成止吐，在DNA-轉(zhuǎn)染復(fù)合物形成時(shí)需用無血清培養(yǎng)基opti-MEM來稀釋DNA和轉(zhuǎn)染試劑宝踪，在轉(zhuǎn)染過程中是可以使用血清的。

轉(zhuǎn)染后6小時(shí)更換培養(yǎng)基碍扔，因?yàn)閘ipo2000具有一定毒性瘩燥。

細(xì)胞培養(yǎng)過程中往往會(huì)添加抗生素來預(yù)防污染，但是抗生素可能對(duì)轉(zhuǎn)染造成困擾不同。比如青霉素和鏈霉素厉膀，青鏈霉素是我們常用來預(yù)防污染的抗生素，就會(huì)影響轉(zhuǎn)染二拐，雖然這些抗生素一般情況下對(duì)于真核細(xì)胞無毒服鹅，但當(dāng)轉(zhuǎn)染試劑增加了細(xì)胞的通透性時(shí)，就會(huì)使抗生素也進(jìn)入細(xì)胞從而間接導(dǎo)致細(xì)胞死亡百新，造成轉(zhuǎn)染效率低企软。

目前轉(zhuǎn)染試劑有些已經(jīng)可以全程都用有血清和抗生素的完全培養(yǎng)基來操作，非常方便吟孙，省去了污染等麻煩。

3聚蝶、觀察轉(zhuǎn)染的效果

在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)杰妓，用熒光顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果并記錄熒光蛋白表達(dá)情況，如下圖所示碘勉，說明轉(zhuǎn)染成功巷挥，且轉(zhuǎn)染效率還可以，如果不帶有熒光验靡，可以用GFP來對(duì)照倍宾，可以放在一個(gè)單獨(dú)的孔中，或是與目標(biāo)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染胜嗓，同時(shí)用Q-PCR和者WB來檢測高职。

轉(zhuǎn)染后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率不高，可以通過兩種方法：

1辞州、復(fù)轉(zhuǎn)染怔锌，即轉(zhuǎn)染后12-24小時(shí)再次進(jìn)行轉(zhuǎn)染，前提是該細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)體的耐受性較好，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞死亡數(shù)較少埃元。

2涝涤、通過藥篩來殺死未轉(zhuǎn)入成功的細(xì)胞。前提是該質(zhì)粒帶有抗生素抗性的基因岛杀。

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