參考課程： 基迪奧GWAS課程：https://www.omicshare.com/class/Home/Index/singlev?id=3

自然群體利用了進(jìn)化過程中的染色體重組示启，容易進(jìn)行基因定位虎敦。

1秩铆、GWAS分析常用的軟件

（1）TASSEL

• 植物類項目應(yīng)用較多线罕，可以矯正群體結(jié)構(gòu)和系譜關(guān)系（Trait Analysis by aSSociation, Evolution and Linkage; Bradbury et al, 2007, Bioinformatics 23:2633-2635）
  （2）EMMA
• 動物類項目應(yīng)用較多隆敢，可矯正系譜關(guān)系（Kang et al, 2008, Genetics 178:1709-1723）
  （3）Plink
• 使用較為簡單（Purcell et al, American Journal of Human Genetics, 2007, 81）

2店雅、表型的處理：線性表型性狀

• 正態(tài)性判斷：R語言的shapiro.test(x)檢驗(yàn)
• 如果是僅個別樣本異常面褐，建議剔除纬黎。如極端值、離開均值大于4倍SD的
• 若整體偏離散（如基因表達(dá)量值）闽晦，建議取log2后扳碍，重新檢驗(yàn)正態(tài)性。

3仙蛉、材料的選擇

主要從兩方面考慮笋敞，一是其LD衰減和重組情況如何、二是群體結(jié)構(gòu)如何荠瘪。

（1）群體的選擇

• 野生品種夯巷、地方品種、培育品種
  不同群體關(guān)聯(lián)分析的效果不同

  
  
• 標(biāo)記的效應(yīng)越弱哀墓，要檢測到這個標(biāo)記所需的樣本數(shù)目就更大趁餐，因此要先考慮研究的性狀是偏質(zhì)量的、還是偏主效基因的篮绰，or前人報道的沒有主效基因的
• 如果是前人報道的無主效基因的后雷，就要考慮增加樣本，或確實(shí)定位不到位點(diǎn)

（2）基因型是否完全覆蓋

• GWAS分析的基礎(chǔ)就是基因與標(biāo)記之間的LD是否連鎖，不同群體的LD衰減距離不同臀突，可以用hyploview進(jìn)行計算勉抓。
  
• 通常當(dāng)兩個位點(diǎn)間R2>0.8時，認(rèn)為兩位點(diǎn)處于完全連鎖不平衡候学，但這種連鎖狀態(tài)會隨區(qū)域增加而不斷降低琳状。
  如何根據(jù)LD衰減距離判斷做GWAS所需的標(biāo)記個數(shù)？盒齿？
• 如果群體的LD衰減距離是100k念逞，那么分析時就要保證每100k至少要有一個marker，那么1M就需要10個边翁、1G就是10w個翎承、3G就需要30w個
• 核心種質(zhì)的LD衰減非常快符匾，因此要增加標(biāo)記密度

（3）基因型判斷群體結(jié)構(gòu)的影響（隨機(jī)背景標(biāo)記）

群體結(jié)構(gòu)（Q矩陣）和個體檢潛在的系譜關(guān)系（K矩陣）叨咖，可能會導(dǎo)致假陽性（如下圖）：

• 群體結(jié)構(gòu)和性狀分布恰好一致，會使人誤以為只要是量群體特有的基因就都是與性狀關(guān)聯(lián)的啊胶，即將區(qū)分群體的背景標(biāo)記認(rèn)為是與性狀相關(guān)的甸各；
• 解決辦法（2種）：
  ① 將群體結(jié)構(gòu)作為協(xié)變量，引入到方程式里焰坪，將群體間的影響校正掉趣倾，剩下的效應(yīng)可能是標(biāo)記的效應(yīng)；

• 計算群體結(jié)構(gòu)（Q矩陣）：用structure或PCA分析的結(jié)果某饰，作為群體結(jié)構(gòu)的協(xié)變量儒恋，將其引入模型 ----- 具體操作見楊曉紅老師GWAS操作教程課件
• 計算個體遺傳關(guān)系（系譜關(guān)系，K矩陣）：用SPAGeDi軟件

4、GWAS分析的多階段設(shè)計

（1）什么是多階段設(shè)計炬守？

• 在人類疾病的GWAS研究中诗越，常用兩階段法分析柠逞，比較嚴(yán)謹(jǐn)术吝。第一階段一般用覆蓋全基因組的位點(diǎn)设拟，第二階段則聚焦在少量的候選位點(diǎn)的測序數(shù)據(jù)進(jìn)行GWAS分析斋扰。

• 單階段：一個群體進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析 → 完成不嚴(yán)謹(jǐn)擅威，一般為動植物類的研究
• 兩階段：
  （1）階段1：找候選關(guān)聯(lián)位點(diǎn)
  小樣本（幾百）全基因組關(guān)聯(lián)分析缕坎，得到候選位點(diǎn)逆甜；
  （2）階段2：候選位點(diǎn)的驗(yàn)證
  已有群體大樣本（成千上萬）或新的獨(dú)立群體，只對候選位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)分析墓捻。
  （2）多階段設(shè)計的優(yōu)點(diǎn)
• 有驗(yàn)證的步驟：可靠；
• 降低成本：第二階段的檢測位點(diǎn)數(shù)較少；
• 解決潛在的多重檢驗(yàn)校正的位點(diǎn)
  高密度芯片or全基因組重測序砖第，SNP數(shù)量可達(dá)1M撤卢，多重檢驗(yàn)過于嚴(yán)格。
  如：1M SNP梧兼，Bonferroni校正的adjusted p value閾值 = 0.05/110-6=510-8（太嚴(yán)格）
• 可以采用的方法：第一階段放松過濾閾值放吩，在第二階段進(jìn)行驗(yàn)證。由于第二階段位點(diǎn)數(shù)較少羽杰，多重檢驗(yàn)校正不會如此嚴(yán)格渡紫。

5、關(guān)聯(lián)分析所需的模型

（1）模型原理

• 固定效應(yīng)1：環(huán)境效應(yīng)考赛，如不同年份惕澎、不同地點(diǎn)數(shù)據(jù)
• 固定效應(yīng)2：位點(diǎn)效應(yīng)
• 固定效應(yīng)3：群體結(jié)構(gòu)效應(yīng)，群體分層導(dǎo)致的颜骤，需要糾正唧喉，樣本所屬的亞群分類信息用Q矩陣表示
• 隨機(jī)效應(yīng)：潛在的系譜關(guān)系，K矩陣
• 隨機(jī)誤差
  關(guān)聯(lián)分析時并不是說所有位點(diǎn)都要考慮忍抽，要結(jié)合自己的情況八孝，選擇合適的

（2）模型的選擇

① 動物

• PCA分析初步判斷；
• 一般而言鸠项，動物類樣本在系譜清晰干跛，且沒有明顯群體結(jié)構(gòu)的情況下，可直接剔除離群樣本祟绊；剔除離群樣本后驯鳖，再將剩下的個體做PCA分析，如果不再存在群體分層久免，即可用一般線性模型做關(guān)聯(lián)分析浅辙；
• 若存在群體分層，再考慮使用Q矩陣進(jìn)行矯正阎姥。

② 植物

• PCA分析初步判斷记舆；
• 植物（尤其作物）因品系間雜交更普遍（如玉米），故群體結(jié)構(gòu)和不同品系間的系譜關(guān)系更普遍呼巴；分析時泽腮，同時使用一般線性模型和不同的混合線性模型，然后比較結(jié)果的好壞衣赶。

（3）如何判斷模型是否合適诊赊？——qq圖

① 正常的qq圖：前貼后起

• GWAS分析后，p-value的-log10從低到高排序府瞄，看其與期望p-value之間的差別）

• 假如標(biāo)記與性狀完全不相關(guān)碧磅，則標(biāo)記的p-value應(yīng)該是正態(tài)分布，因此會一直沿著直線走，并且實(shí)際情況下鲸郊，絕大部分標(biāo)記確實(shí)是跟性狀不相關(guān)丰榴。到了后期，標(biāo)記的顯著性增高秆撮，可能開始與性狀之間存在相關(guān)四濒，因此其觀測到的p值會顯著高于期望p值。

② 異常情況：過度矯正

• 過度矯正的可能原因：
  a. 群體結(jié)構(gòu)或kinship矯正過于嚴(yán)格职辨，導(dǎo)致觀測值＜期望值盗蟆；
  b. 期望p-value的隨機(jī)分布是基于位點(diǎn)之間互相獨(dú)立的假設(shè)，高通量測序or高密度芯片會導(dǎo)致很多相鄰位點(diǎn)間存在連鎖or相關(guān)關(guān)系舒裤，這樣的話觀測到的p值就不是完全隨機(jī)的喳资，若位點(diǎn)間實(shí)際存在

（4）關(guān)聯(lián)分析的模型選擇

• 做任何性狀的關(guān)聯(lián)分析時，都需要用至少2個模型進(jìn)行模擬惭每，判斷最佳模型

  
  

（5）不同分析方法的最適范圍：

6骨饿、示例：GWAS分析的一般步驟

step 1：通過進(jìn)化樹和PCA分析，看群體分層情況

step 2：不同模型的比較 —— 找出最佳模型

step 3：分群體和全群體分析 —— 當(dāng)存在明顯的群體分層時

Step 4：對定位到的位點(diǎn)的解讀：優(yōu)先解讀可解讀的台腥，再去挖掘其他的

step 5： 結(jié)合RNA-seq或群體遺傳學(xué)等其他方法來驗(yàn)證這個位點(diǎn)附近的基因可能是與性狀相關(guān)的