縱向微生物組研究可以捕捉微生物組內(nèi)的時(shí)間變化，以獲得對(duì)微生物系統(tǒng)的機(jī)理認(rèn)識(shí)结借。近日筐摘，《Briefings in Bioinformatics》發(fā)表綜述文章，回顧了縱向微生物組研究的現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)方法，以強(qiáng)調(diào)其優(yōu)勢(shì)和局限性咖熟。

縱向微生物組研究

分析目標(biāo)

一項(xiàng)成功的研究始于清晰圃酵、明確的科學(xué)研究目標(biāo)♀晒埽縱向微生物組研究的共同目標(biāo)：

1）研究感興趣的群體（如病例與對(duì)照組郭赐、疾病或治療組）之間的微生物豐度如何隨時(shí)間變化，以及微生物豐度與其他因素（如臨床結(jié)果确沸、疾病或治療）之間的關(guān)聯(lián)如何隨時(shí)間變化捌锭。在這種情況下，時(shí)間和患者或單個(gè)組之間差異都可能是有意義的罗捎。

2）對(duì)具有類似時(shí)間豐度模式的微生物進(jìn)行分組观谦。這種分析往往要求我們首先對(duì)每種微生物的時(shí)間軌跡進(jìn)行建模。

3）構(gòu)建一個(gè)微生物網(wǎng)絡(luò)宛逗，了解各組微生物之間的時(shí)間關(guān)系坎匿。

研究設(shè)計(jì)

縱向微生物組數(shù)據(jù)通常來自兩種不同的情況：來自設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)（如小鼠）[L1]和人類隨訪或隊(duì)列研究[L2]。對(duì)于L1類縱向數(shù)據(jù)雷激，時(shí)間點(diǎn)通常比L2研究緊密，每個(gè)受試者的時(shí)間點(diǎn)數(shù)量相同（或非常相似）告私。相比之下屎暇，L2類數(shù)據(jù)通常具有受試者時(shí)間點(diǎn)數(shù)量不均勻和時(shí)間點(diǎn)間隔不均勻的特點(diǎn)。此外驻粟，在L2研究中根悼，一些外部因素（如飲食）也可能影響微生物組，但可能經(jīng)常無法測(cè)量或不受控制蜀撑，這使得建模更具挑戰(zhàn)性挤巡。

數(shù)據(jù)特征

L1和L2設(shè)計(jì)均使用擴(kuò)增子或宏基因組測(cè)序來生成原始數(shù)據(jù)。由于微生物組數(shù)據(jù)的性質(zhì)酷麦，這兩種測(cè)序方法產(chǎn)生的數(shù)據(jù)具有許多分析挑戰(zhàn)矿卑，這些數(shù)據(jù)稀疏、過度分散沃饶、高維母廷、多線性、多變量和高度可變糊肤。

縱向微生物組研究的統(tǒng)計(jì)方法

鑒定不同時(shí)間琴昆、不同組別、不同組別和不同時(shí)間之間豐度不同的微生物

當(dāng)前方法

1. Zero-inf lated beta regression Model

ZIBR可以同時(shí)評(píng)估每個(gè)分類群隨時(shí)間和組間的豐度變化馆揉。適用于相對(duì)豐度（比例）數(shù)據(jù)业舍，并使用伯努利分布捕捉微生物的存在或不存在，以及使用貝塔分布捕捉非零豐度。ZIBR具有高度的可行性舷暮，可以評(píng)估分析目標(biāo)1中說明的所有效應(yīng)态罪。

其優(yōu)點(diǎn)之一是它能夠通過使用邏輯組件來解釋數(shù)據(jù)的稀疏性。然而脚牍，ZIBR有幾個(gè)局限性：該模型沒有明確說明模型中的受試者內(nèi)相關(guān)結(jié)構(gòu)（即自回歸相關(guān)結(jié)構(gòu)）向臀；ZIBR無法處理給定主題在給定時(shí)間點(diǎn)丟失的數(shù)據(jù)等。

2.Negative binomial mixed model

NBMM可以檢測(cè)微生物計(jì)數(shù)（無轉(zhuǎn)換）與協(xié)變量（如治療诸狭、表型券膀、年齡、飲食習(xí)慣等）之間的關(guān)聯(lián)驯遇，同時(shí)考慮受試者內(nèi)部和之間微生物豐度的時(shí)間趨勢(shì)芹彬。NBMM模型可以用不同的固定效應(yīng)進(jìn)行擬合，如時(shí)間效應(yīng)叉庐、治療效應(yīng)以及時(shí)間和治療之間的交互作用舒帮。因此，與ZIBR相似陡叠，NBMM也可以評(píng)估分析目標(biāo)1中說明的所有效應(yīng)玩郊。

NBMM可以適應(yīng)同一受試者觀察結(jié)果之間不同的相關(guān)結(jié)構(gòu)，而ZIBR則沒有這種靈活性枉阵。然而該方法沒有明確地處理零膨脹译红。

3.Block Bootstrap Method

BBM是縱向微生物組計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)引導(dǎo)法的擴(kuò)展，其旨在確定樣本組之間的差異豐度兴溜，但不關(guān)注時(shí)間效應(yīng)侦厚。因此，該方法只能識(shí)別組間差異表達(dá)的分類群拙徽。BBM是非參數(shù)的刨沦，不需要特定的數(shù)據(jù)分布。它可以處理對(duì)象內(nèi)的依賴性膘怕，并解釋不同的庫大小想诅，以解決數(shù)據(jù)的組成性質(zhì)。

作為限制因素淳蔼，該方法計(jì)算量大侧蘸，需要足夠多的時(shí)間點(diǎn)（至少五個(gè)）來指定兩個(gè)調(diào)整參數(shù)（初始區(qū)塊大小、子采樣的重復(fù)觀察數(shù)）鹉梨。稀疏性和可變性仍然存在問題讳癌，需要預(yù)先過濾，以去除由于時(shí)間變化（技術(shù)和生物來源）造成的不必要的噪音存皂。BBM不考慮其他協(xié)變量晌坤，當(dāng)所有受試者的觀察次數(shù)相同時(shí)逢艘，其表現(xiàn)最佳。在解釋方面骤菠，該方法評(píng)估了一個(gè)樣本組的豐度是否高于另一個(gè)它改，但沒有量化這種差異。

4.?SplinectomeR

SplinectomeR是一個(gè)R包商乎，它使用加權(quán)局部多項(xiàng)式（Loess splines）來總結(jié)縱向研究中假設(shè)檢驗(yàn)的數(shù)據(jù)央拖。

SplinectomeR中的方法易于解釋，可以直接比較多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的觀察結(jié)果鹉戚，而無需對(duì)這些時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行平均或匯總鲜戒。它們還可以處理缺失或不平衡的數(shù)據(jù)。然而抹凳，這些方法可能會(huì)受到異常值的影響遏餐，特別是在稀疏數(shù)據(jù)集中，并且不考慮組成數(shù)據(jù)赢底。

5.Zero-inf lated Gaussian mixed models

ZIGMM用于解釋受試者內(nèi)的相關(guān)性和微生物組數(shù)據(jù)的其他特性失都。與上述所有方法類似，ZIGMM也是單變量的幸冻。與其他兩種零信息方法ZIBR和ZINBMM相比粹庞，ZIGMM在計(jì)算效率方面優(yōu)于以前開發(fā)的各種方法。與ZIBR和NBMM類似洽损，ZIGMM還可以評(píng)估時(shí)間效應(yīng)信粮、組效應(yīng)和時(shí)間×組相互作用效應(yīng)。

ZIGMM的主要優(yōu)點(diǎn)是能夠模擬受試者內(nèi)樣本之間的時(shí)間依賴性效應(yīng)和相關(guān)性趁啸。此外，該方法可以包括正態(tài)分布和零相關(guān)模型的各種固定效應(yīng)和隨機(jī)效應(yīng)督惰。該方法還可以解釋樣本之間不同的自回歸相關(guān)結(jié)構(gòu)不傅。最后，該方法可以分析微生物組比例數(shù)據(jù)以及擴(kuò)增子或宏基因組測(cè)序技術(shù)生成的計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)赏胚。然而访娶，ZGMM也遇到了控制假陽性率的擬合問題，特別是在分析復(fù)雜數(shù)據(jù)（包括宏基因組學(xué)）時(shí)觉阅。

6.Bayesian semi-parametric generalized linear model

該方法使用具有均值約束的正則先驗(yàn)來避免可識(shí)別性問題崖疤，并在微生物變量、樣本和時(shí)間點(diǎn)之間借用信息典勇。由于數(shù)據(jù)的高維性和協(xié)變量之間的高度相關(guān)性劫哼，產(chǎn)生了稀疏估計(jì)。與其他方法相比割笙，這種方法是多變量的权烧。然而眯亦，需要更多的發(fā)展來靈活捕捉響應(yīng)函數(shù)中的不同形狀，納入變量選擇般码，并允許時(shí)間相關(guān)的協(xié)變量妻率。由于數(shù)據(jù)稀疏性，必須謹(jǐn)慎處理后驗(yàn)計(jì)算板祝，并且需要納入先驗(yàn)信息以進(jìn)行準(zhǔn)確推斷宫静。

7.?Fast zero-inf lated negative binomial mixed model

FZINBMM模型可以評(píng)估時(shí)間和群體效應(yīng)以及時(shí)間×群體相互作用效應(yīng)。在此前的模擬和真實(shí)數(shù)據(jù)評(píng)估中FZINBMM在經(jīng)驗(yàn)?zāi)芰蜋z測(cè)到的分類群的高比例方面優(yōu)于其他計(jì)數(shù)方法券时，如LMMs孤里、NBMMs和ZIGMMs。然而革为，當(dāng)數(shù)據(jù)不是高度稀疏時(shí)扭粱，F(xiàn)ZINBMM的表現(xiàn)與ZIGMMs和NBMMs相似。

性能評(píng)估

研究團(tuán)隊(duì)模擬數(shù)據(jù)以評(píng)估不同豐度方法的性能：除ZIGMM外震檩，基于計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)的所有其他方法（NBMM琢蛤、FZINBMM）在檢測(cè)時(shí)間效應(yīng)和群體效應(yīng)方面表現(xiàn)良好。然而抛虏，ZIGMM計(jì)數(shù)模型在檢測(cè)具有時(shí)間和組交互效應(yīng)的變量方面優(yōu)于所有方法博其。在基于相關(guān)數(shù)據(jù)的方法（例如ZIGMM、SplinectomeR）中迂猴，ZIBR在檢測(cè)時(shí)間和組效應(yīng)方面表現(xiàn)良好慕淡。

研究團(tuán)隊(duì)將所有方法應(yīng)用于一項(xiàng)縱向研究，調(diào)查抗生素治療后抗萬古霉素腸球菌（VREfm）定植期間腸道微生物組的作用：除ZIBR和SplinectomeR外沸毁，由于方法的技術(shù)限制峰髓，所有其他方法在模型擬合過程中至少會(huì)出現(xiàn)一個(gè)錯(cuò)誤；FZINBMM產(chǎn)生的顯著分類群數(shù)量最多息尺，這一結(jié)果可能是由于與初始階段相比携兵，抗生素和VREfm效應(yīng)較大。

識(shí)別具有類似時(shí)間模式的微生物

?當(dāng)前方法

1.動(dòng)態(tài)時(shí)間規(guī)整（DTW）距離

一種基于動(dòng)態(tài)時(shí)間規(guī)整（DTW）距離的聚類方法以識(shí)別具有相似時(shí)間模式的分類群搂誉。與基于歐氏距離的聚類方法相比徐紧，DTW考慮到了跨時(shí)間序列的失真，因此適用于識(shí)別異相的時(shí)間行為炭懊。

2.?圍繞中心點(diǎn)分割和層次聚類

一項(xiàng)研究中研究人員將這兩類聚類算法應(yīng)用于微生物組時(shí)間序列數(shù)據(jù)并级。圍繞medoids的分區(qū)（PAM）是一種實(shí)現(xiàn)k-medoids聚類的流行算法，據(jù)此侮腹，數(shù)據(jù)被分配到k個(gè)聚類中（類似于k-means聚類）嘲碧。在k-medoids聚類中，每個(gè)聚類由聚類中最中心的medoid代表凯旋。一個(gè)medoid是一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)呀潭，它使自己與集群中所有其他數(shù)據(jù)點(diǎn)之間的平均不相似度最小钉迷。由于PAM使用medoids而不是平均值，因此與k-means聚類相比钠署，該方法對(duì)噪聲和異常值的敏感性較低糠聪。Hclust是一種分層聚類算法，它采用自底向上的方法根據(jù)相似性對(duì)分類群進(jìn)行分組谐鼎。

3.?使用主成分分析和稀疏主成分分析進(jìn)行聚類

多變量降維技術(shù)主成分分析（PCA）和稀疏主成分分析（sPCA）被用來對(duì)具有類似時(shí)間模式的分類群進(jìn)行聚類舰蟆。當(dāng)時(shí)間點(diǎn)的數(shù)量較少（即5-10個(gè)）讶迁，并且預(yù)計(jì)數(shù)據(jù)在不同時(shí)間段遵循規(guī)律和類似的趨勢(shì)時(shí)本鸣，這些方法最適合灸眼。

性能評(píng)估

研究團(tuán)隊(duì)模擬數(shù)據(jù)以評(píng)估聚類方法的性能：與其他聚類方法（即PCA窍侧、DTW、層次聚類）相比台颠，k-medoid聚類的中值聚類精度最高瞎嬉。然而姐赡，正如預(yù)期的那樣唐片，隨著噪聲水平的增加丙猬，所有方法的聚類精度都會(huì)降低。k-medoid聚類费韭、DTW和層次聚類都具有相似的中值聚類精度茧球，但DTW在其精度上具有很高的可變性。

聚類方法分別應(yīng)用于VREfm案例兩組：初始階段（對(duì)照組）和VRE階段（治療組）星持。所有四種方法都將與VREfm相關(guān)的分類群（即腸球菌科）劃分為一個(gè)小類群抢埋，表明其與其他劃分為較大類群的分類群不同。此外督暂，治療組中屬于類桿菌科的兩個(gè)分類群的豐度隨著時(shí)間的推移而增加揪垄，并通過PCA和DTW聚類被分配到同一個(gè)聚類，表明這兩種方法表現(xiàn)良好逻翁。

了解微生物之間的生物和時(shí)間關(guān)系

?當(dāng)前方法

1.Two-stage dynamic Bayesian Nnetwork

TS-DBN構(gòu)建具有離散和連續(xù)變量的網(wǎng)絡(luò)福侈，其中在離散變量上指定條件概率分布，在連續(xù)變量上定義條件線性高斯密度函數(shù)卢未。在樣本量較小的情況下，納入臨床和人口統(tǒng)計(jì)學(xué)變量可能會(huì)導(dǎo)致過度擬合堰汉。目前辽社，該方法僅限于兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，對(duì)于稀有分類群可能表現(xiàn)不佳翘鸭，因?yàn)榫W(wǎng)絡(luò)連接顯示出較低的置信度滴铅。

2.Granger causality based interaction networks

web應(yīng)用程序“TIME”中的網(wǎng)絡(luò)模型基于Granger因果關(guān)系，該因果關(guān)系評(píng)估給定個(gè)體兩個(gè)分類群“A”和“B”之間的成對(duì)因果關(guān)系就乓。除了成對(duì)Granger因果關(guān)系外汉匙，該方法還使用“Granger-Lasso因果關(guān)系”識(shí)別所有分類群之間的潛在因果關(guān)系拱烁。這些網(wǎng)絡(luò)中的因果關(guān)系是統(tǒng)計(jì)預(yù)測(cè)，不能解釋因果關(guān)系（相互作用可能是由于間接原因）噩翠。因此戏自，應(yīng)謹(jǐn)慎解釋。結(jié)合其他功能數(shù)據(jù)伤锚，如代謝相關(guān)性擅笔，可以加強(qiáng)解釋。這種方法的一個(gè)局限性是在構(gòu)建交互網(wǎng)絡(luò)時(shí)沒有考慮臨床或人口統(tǒng)計(jì)學(xué)變量屯援。

3.?Microbial time-series prior Lasso

MTPLasso可以推斷微生物之間的相互作用猛们。與基于Granger因果關(guān)系的交互網(wǎng)絡(luò)類似，該方法也用于開發(fā)針對(duì)個(gè)體的網(wǎng)絡(luò)狞洋。與之前的方法類似弯淘，MTPLasso在建模交互網(wǎng)絡(luò)時(shí)也忽略了任何臨床或人口統(tǒng)計(jì)學(xué)變量。

差異豐度和聚類方法的主要局限性是數(shù)據(jù)的組成性質(zhì)吉懊。通過忽略組成性庐橙，這些方法可能會(huì)產(chǎn)生有偏見或誤導(dǎo)性的結(jié)果。此外惕它，大多數(shù)差異豐度方法是單變量的怕午，因此忽略了微生物之間的相互關(guān)系，這可能導(dǎo)致虛假結(jié)果淹魄。在實(shí)踐中郁惜，研究人員可能傾向于為所有分類群擬合特定方法，而不管其稀疏程度如何甲锡。因此兆蕉，可以通過更大的靈活性來改進(jìn)零相關(guān)模型，根據(jù)每個(gè)分類單元的稀疏程度包括或排除其零相關(guān)部分缤沦。

網(wǎng)絡(luò)模型有望用于縱向微生物組數(shù)據(jù)分析虎韵，但仍處于起步階段。這些模型推斷微生物之間的相互作用缸废，以了解微生物在疾病中的作用和影響包蓝，以及它們隨時(shí)間的協(xié)同進(jìn)化。另一種分析是調(diào)查微生物網(wǎng)絡(luò)隨時(shí)間的變化（例如由于抗生素干預(yù)）企量。網(wǎng)絡(luò)模型未來有希望的應(yīng)用是設(shè)計(jì)合成微生物組來驗(yàn)證數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)的生態(tài)網(wǎng)絡(luò)测萎。

由于篇幅有限，更多方法細(xì)節(jié)可參考文獻(xiàn)原文~本文所有分析都是使用R進(jìn)行的届巩，可通過如下鏈接上的代碼完全重現(xiàn) ：

https://github.com/SarithaKodikara/Longitudinal_microbiome_data_analysis??

首發(fā)公號(hào)國家基因庫大數(shù)據(jù)平臺(tái)

參考文獻(xiàn)

Kodikara S, Ellul S, Lê Cao K A. Statistical challenges in longitudinal microbiome data analysis[J]. Briefings in Bioinformatics, 2022, 23(4): bbac273.

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