title：The adult human testis transcriptional cell atlas

journal：cell research

IF：17.8

摘要：成年人的精子發(fā)生包含了精原干細(xì)胞的自我更新和分化過程苟径，與此同時還有生殖細(xì)胞與周圍環(huán)境的相互作用，以確保長期的生殖能力和可靠的基因組復(fù)制，在這里，我們進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測序，樣本來自年輕成年個體的6500個睪丸細(xì)胞，我們發(fā)現(xiàn)了五種睪丸體細(xì)胞（間質(zhì)細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞赃额，支持細(xì)胞，肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）叫确，同時觀察到生殖細(xì)胞與環(huán)境的互作以及人與鼠的不同之處跳芳。精子發(fā)生，是一個精密建立的過程启妹，包含一些編碼筛严、非編碼及重復(fù)片段的轉(zhuǎn)錄活動。有趣的是饶米，我們發(fā)現(xiàn)了五種分離的轉(zhuǎn)錄/發(fā)育中的精原細(xì)胞狀態(tài)桨啃，其中包括了一種新的較早時期的精原干細(xì)胞階段，在此定義為state0.表觀特征及轉(zhuǎn)錄分析揭示了在精原細(xì)胞階段發(fā)育的可塑性檬输，為了理解state0的來源照瘾，我們使用嬰兒的睪丸細(xì)胞做了轉(zhuǎn)錄組，確定了成年人中的state0與嬰兒精原干細(xì)胞的相似性丧慈∥雒總之，我們的數(shù)據(jù)集描述了關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄和表觀特征逃默，同時發(fā)現(xiàn)了生殖細(xì)胞發(fā)育轉(zhuǎn)化過程及其可塑性鹃愤。

介紹：人類精子發(fā)生過程需要維持精原干細(xì)胞的自我更新和分化過程的平衡，隨后會在軸為環(huán)境的主導(dǎo)下完成多個過程的轉(zhuǎn)化完域，然后進(jìn)入有絲分裂和減數(shù)分裂软吐，隨后是精子的成熟過程。

這其中的很多生物學(xué)問題可以通過單細(xì)胞測序過程解決吟税，比如是那些分子特征保證了精原干細(xì)胞可以作為一種長期的成年的生殖干細(xì)胞凹耙？精原干細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過程（從起源到幼稚期到靜息階段發(fā)育成精原細(xì)胞）是如何實(shí)現(xiàn)的？這些過程是否是不可逆的肠仪？或者是精原細(xì)胞的發(fā)育是否存在雙向的可塑性確保精原干細(xì)胞池可以長存肖抱？精原細(xì)胞時期結(jié)束后，有哪些過程在隨后的轉(zhuǎn)錄和信號過程中發(fā)揮作用异旧？這些過程是如何影響體細(xì)胞與生殖細(xì)胞的交流意述，這些交流的分子是否是特殊的一些信號或者轉(zhuǎn)錄通路，從而調(diào)控精原細(xì)胞的自我更新、增殖代謝和轉(zhuǎn)化荤崇？

在此我們使用了10X的平臺對年輕成年人的睪丸細(xì)胞進(jìn)行分析镐依，找到了五個分離的精原細(xì)胞狀態(tài)，同時發(fā)現(xiàn)了一種新的狀態(tài).有趣的是天试，結(jié)合RNA動力學(xué)分析和染色質(zhì)可及性分析及DNA甲基化分析，我們發(fā)現(xiàn)了人精原細(xì)胞分化過程中的可塑性然低。

結(jié)果：

1喜每、細(xì)胞組分分離和鑒定

篩選標(biāo)準(zhǔn)：250k reads/cell ，2500 gene/cell?

macrophages CD14 CD163 C1QA

endothelial cell VWF PECAM1 NOTCH4 JAG1 HES1 MAML1

myoid MYH11 ACTA2

sertoli cell SOX9 AMH ITGA6

lydig cell DLK1 IGF1

SSC marker UTF1 ID4 FGFR3

differentiating marker KIT DMRT1

meiosis marker SYCP3 SPO11 MLH3

spermatid structure protein SPAG6 ZZPBP CAMK4 CREM?

nuclear condensation protamine repackaging factor TNP1 PRM2

定義前細(xì)線期雳攘、細(xì)線期带兜、偶線期、粗線期吨灭、后粗線期刚照、雙線期的marker：STRA8 REC8 SPO11 SYCP1 PRDM9 MSH5 MSH4 MLH3 CCNA1

2、人和小鼠的睪丸環(huán)境及體細(xì)胞與生殖細(xì)胞互作的比較

以前的研究報道了支持細(xì)胞中表達(dá)CXCL12作為CXCR4的配體來幫助維持精原干細(xì)胞的狀態(tài)喧兄，而在人中无畔，這種配體在間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，而CXCR4則在巨噬細(xì)胞和精原細(xì)胞中都表達(dá)吠冤。說明了CXCL12-CXCR4在人中會促進(jìn)巨噬細(xì)胞和精原細(xì)胞的共定位浑彰。再者，CSF1R,作為CSF1的受體拯辙，在人中特異性表達(dá)在巨噬細(xì)胞中郭变，而在小鼠中表達(dá)在精原細(xì)胞中。

在人類中涯保，支持細(xì)胞表達(dá)ITGA6诉濒，這是一種整合素，可在曲細(xì)精管的基底部發(fā)現(xiàn)夕春。同時支持細(xì)胞會表達(dá)WFDC2和PRND未荒。前者是一種附睪蛋白會促進(jìn)精子成熟，后者是一種錨定蛋白會與生殖細(xì)胞上的受體互作撇他。

在間質(zhì)細(xì)胞中也會有特異表達(dá)的基因茄猫，比如IGFBP5 IGFBP3和INHBA以及VIT。有趣的是睪酮合成相關(guān)的基因如STAR和HSD17B3會在支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá)困肩，而其效應(yīng)基因如SHBG等在成熟的精子中表達(dá)划纽。RA合成的相關(guān)基因如ALDH1A1和ALDH1A3，高表達(dá)于間質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞锌畸，而其靶基因STRA8勇劣，只在精原細(xì)胞向精母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化時期表達(dá)。WNT信號通路中的配體WNT2B最初表達(dá)在內(nèi)皮細(xì)胞中，而其受體則表達(dá)在精母細(xì)胞中比默，這說明其重要的作用幻捏。

PDGFB表達(dá)在內(nèi)皮細(xì)胞中，而它的受體PDGFRA和PDGFRB則在間質(zhì)細(xì)胞和肌細(xì)胞中表達(dá)命咐，說明其可能是通過于其他生境細(xì)胞互作而間接影響生境過程的篡九。

PS，可以在GSEA的數(shù)據(jù)庫中查找別的信號通路醋奠，看一下表達(dá)模式

3榛臼、擬時序分析和聚類分析揭示了精子發(fā)生過程中的劇烈的基因表達(dá)模式

聚類分析中的熱圖解讀：行代表基因，列代表按照逆事件順序排列的基因

GO分析窜司，根據(jù)每個cluster代表的細(xì)胞所發(fā)生的生物學(xué)過程排序沛善，上調(diào)和下調(diào)的GO都做（重點(diǎn)！Ｈ怼＝鸬蟆）

差異基因的篩選使用了bimodel test ，閾值FDR<0.01,logFC的絕對值大于0.25

4议薪、轉(zhuǎn)座元件尤蛮、lncRNA和XIST的生殖系表達(dá)的動力學(xué)

XIST和MSCI：XIST在精原細(xì)胞階段出現(xiàn)表達(dá)，同時發(fā)現(xiàn)在精原細(xì)胞階段靠近X失活中心的基因被選擇性的抑制笙蒙，揭示了XIST介導(dǎo)的時候過程抵屿，MSCI指的是meiotic sex chromosome inactivation

5、減數(shù)分裂的細(xì)胞的分析揭示了在減數(shù)分裂轉(zhuǎn)化過程中的劇烈變化和關(guān)鍵調(diào)控因子捅位。

我們發(fā)現(xiàn)DMRT和SOX家族的蛋白的動態(tài)表達(dá)模式轧葛，這于他們在小鼠減數(shù)分裂進(jìn)入過程的抑制作用是一致的，DMRT1和SOX4只表達(dá)在前細(xì)線期艇搀。

5尿扯、已知的和未知的精原干細(xì)胞狀態(tài)的定位

重聚類了早期精原細(xì)胞，獲得了四個與以前報道相似的簇和一個以前未被報道的簇焰雕，同時發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄活動中的劇烈的轉(zhuǎn)化在1-2的階段轉(zhuǎn)變中（這個是重點(diǎn)Ｖ运瘛！＞仄ā）辟宗，說明這個轉(zhuǎn)化是比較重要的發(fā)育節(jié)點(diǎn)。

盡管state0和state1有一些細(xì)胞共表達(dá)一些關(guān)鍵的干細(xì)胞信號因子和轉(zhuǎn)錄因子吝秕，我們的分析發(fā)現(xiàn)了有490個基因在state0中特異性表達(dá)或者有較高的表達(dá)泊脐，比如說PIWIL4 EGR4 TSPAN33 PHGDH PPP1R36等

一些已知的早期SSC的marker基因如ID4 FGFR3 TCF3 UTF1等在stat0和stat1中表達(dá)，而一些分化（KIT）或者擴(kuò)增（MKI67）等基因卻發(fā)現(xiàn)是在State2中高表達(dá)烁峭，這說明0和1是兩個代表ssc靜息狀態(tài)的中間階段容客。有趣的是大多數(shù)state0低表達(dá)ST3GAL2秕铛，這是一種參與SSEA4形成的酶，這說明0這個狀態(tài)并不能表達(dá)精原細(xì)胞的表面marker

6缩挑、RNA速度分析及染色質(zhì)狀態(tài)揭示精原干細(xì)胞的可塑性

隨后做了RNA速度分析但两，這是通過利用新生的轉(zhuǎn)錄來推測發(fā)育的軌跡。這個算法中每個轉(zhuǎn)錄本的未剪接讀數(shù)與剪接讀數(shù)之比被用作新轉(zhuǎn)錄量的代理測量供置。（原文Here, the ratio of unspliced to spliced reads for each transcript is used as a proxy measurement of new transcription.）谨湘，通過比較其他細(xì)胞中穩(wěn)定狀態(tài)（spliced）的轉(zhuǎn)錄本，一個可以用來代表每個細(xì)胞未來的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的速度向量就可以被計算出來芥丧，在tsne圖中悲关，向量的長度和方向代表了細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄軌跡，這個分析揭示了兩個信息娄柳，第一個是在state0中，我們發(fā)現(xiàn)存在兩個亞群艘绍，其中一個亞群的向量指向state1赤拒，說明它會向1階段發(fā)展，而第二個亞群沒有很明確的指向诱鞠，這兩個亞群的模式說明了前者的細(xì)胞亞群具有向1階段發(fā)展的趨勢挎挖，可能是受到特殊的發(fā)育信號的調(diào)控，而后者則沒有航夺。第二個現(xiàn)象是蕉朵，在state2中，我們發(fā)現(xiàn)其中有一部分的細(xì)胞的向量指向了state1阳掐，說明人類精原細(xì)胞的發(fā)育是有可塑性的始衅。

7、成年人state0與胎兒的生殖細(xì)胞狀態(tài)很相似

為了驗證state0是代表最早期的ssc的細(xì)胞缭保，我們使用了12-13個月大的胎兒的睪丸細(xì)胞汛闸，通過QC后獲得了1300多個這樣的細(xì)胞，其中也包含了一些體細(xì)胞艺骂。tsne和擬時間分析發(fā)現(xiàn)胎兒的生殖細(xì)胞非常接近state0細(xì)胞诸老，處于發(fā)育軌跡的最開始的位置，更重要的是钳恕，大多數(shù)的state0的marker高表達(dá)于胎兒生殖細(xì)胞中别伏。其中也包含了一些重要的轉(zhuǎn)錄因子（TBX3 HOXA3）等是特異性表達(dá)在胎兒生殖細(xì)胞中的，這可能導(dǎo)致了出現(xiàn)差異的原因

8忧额、確定精原干細(xì)胞的狀態(tài)通過隨后的mrna原位熒光雜交

9厘肮、state0的markerTSPAN33顯示與高表達(dá)的FGFR3共定位

使用鑒定得到的TSPAN33作為state0的表面marker對0階段的細(xì)胞進(jìn)行富集，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞都表達(dá)高的FGFR3同時低表達(dá)SSEA4宙址。

10轴脐、早期精原干細(xì)胞狀態(tài)的原位觀察通過蛋白免疫熒光

除了使用實(shí)驗外，還引入了人類蛋白圖譜的數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)加以佐證。

技術(shù)參數(shù)：

1大咱、10X平臺+ illumina hiseq2500

2恬涧、下機(jī)數(shù)據(jù)使用cell ranger v1.2.1處理

3、下游處理

細(xì)胞身份確定：Seurat 碴巾，篩選標(biāo)準(zhǔn)是500genes/cell 20%線粒體基因/cell 標(biāo)準(zhǔn)化：scaledata函數(shù)溯捆，var。regress=“nUMI"和“mitochondria percentage”厦瓢，使用RunCCA去除批間差提揍，最后選5000個hvg以及1—15PC作為聚類依據(jù)

擬時間分析：slingshot

細(xì)胞周期分析：scran

調(diào)控子分析：SCENIC

RNA速度分析：Velocyto.R