比較基因組學
????????簡單介紹一下比較基因組學酱讶，Comparative genomics是基于基因組圖譜和測序技術(shù)瓷式，對已知的基因特征和基因組結(jié)構(gòu)進行比較以了解基因功能、表達機制和不同物種親緣關(guān)系的生物學研究。
????????通過對不同親緣關(guān)系物種的基因組序列比較捅僵，能夠鑒定出編碼序列钱反、非編碼序列及給定物種獨有的序列掖看。而基因組范圍內(nèi)的序列比對，可以了解不同物種核苷酸組成面哥、同/共線性關(guān)系和基因順序異同哎壳，有助于理解基因分析定位、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系尚卫。
????????其中归榕，比較基因組學的重要一部分正是系統(tǒng)進化關(guān)系的研究，由此對基因家族分析吱涉，基于單拷貝基因的串聯(lián)比對分析構(gòu)建系統(tǒng)進化樹是其中的一環(huán)刹泄。所以，下面簡單介紹基因家族分析的重要程序OrthoMCL和OrthoFinder怎爵。
OrthoMCL (http://orthomcl.org/orthomcl/) 尋找同源基因工具
????????OrthoMCL (http://orthomcl.org/orthomcl/) 是現(xiàn)在用的最多的一款來找直系同源基因（Orthologs）以及旁系同源基因 (Paralog) 的軟件 特石，同源基因的定位和注釋在對基因組后續(xù)分析中至關(guān)重要。它主要在比較完整的基因組之間找直系同源基因鳖链。OrthoMCL的使用主要有13步姆蘸，官方在2013年公布OrthoMCL v2.0版本就很久沒有更新過。從v1.4最初版本說明文檔可以了解OrthoMCL的使用步驟，大體有Mysql數(shù)據(jù)庫配置乞旦、修改OrthoMCL配置文件贼穆、轉(zhuǎn)換序列格式、過濾兰粉、比對故痊、解析結(jié)果和聚類等步驟，特別麻煩玖姑。并且由于MySql數(shù)據(jù)庫的安裝和配置的過程也需要管理員權(quán)限愕秫。
????????Github上的一款工具OrthoMCL Pipeline (https://github.com/apetkau/orthomcl-pipeline) 能夠很好的解決這些繁瑣的步驟和分析過程中的繁瑣參數(shù)設(shè)置。這個工具的安裝過程雖然復雜焰络，但是在最后的使用是舒爽的很戴甩。
OrthoMCL-pipline的安裝、配置及其使用
????OrthoMCL-pipline的安裝不僅需要工具OrthoMCL所依賴的MySql數(shù)據(jù)庫外還需要工具所必須的perl模塊環(huán)境闪彼，在對MySql數(shù)據(jù)庫的搭建成功后甜孤，才可以對接下來的pipline工具進行配置。
? ??主要安裝步驟如下：
????????1.在VMware上安裝Ubuntu系統(tǒng)
? ? ? ? 由于MySql數(shù)據(jù)庫的搭建和配置需要管理員權(quán)限畏腕，并且處于對實驗室服務(wù)器的保護缴川，我自己在電腦上安裝了虛擬機進行操作。對于VMware的安裝描馅、Ubuntu的安裝把夸，此處略過。
? ? ? ? 2. Mysql數(shù)據(jù)庫的安裝及其配置
? ? ? ? 由于對于老版本的OrthoMCL的執(zhí)拗铭污，之前一直嘗試利用源碼在Ubuntu上安裝MySql數(shù)據(jù)庫恋日，以便能夠修改MySql配置滿足OrthoMCl應用。最后通過MySql的官方網(wǎng)站和看了些資料認識到可以直接下載MySql-Server解決問題嘹狞，不用從源碼安裝MySql這么費時費力岂膳，最新版MySql8.0版本的安裝可以按照官方指導安裝：https://websiteforstudents.com/install-mysql-8-0-on-ubuntu-16-04-17-10-18-04/。但是我們要按照其中這個連接中的方法安裝5.7版本磅网，而不是最新版MySQL闷营，因為最新版本會在orthomcl第十部報錯。
? ? ????按照鏈接中的教程安裝MySQL知市，在如下這一步確定之后，記得選擇5.7的版本速蕊，最新版本與老版本orthomcl會在第十步?jīng)_突嫂丙。
3. 安裝OrthoMCL-pipline的依賴perl模塊和配置
? ? ? ? 安裝好mysql5.7后规哲，就是一些模塊的安裝跟啤。
????????git獲得pipline工具
? $ git clone https://github.com/apetkau/orthomcl-pipeline.git
? ? ? ? ?需要的perl依賴模塊：? BioPerl、DBD::mysql、DBI隅肥、Parallel::ForkManager竿奏、Schedule::DRMAAc、YAML::Tiny腥放、Set::Scalar泛啸、Text::Table、Moose秃症、SVG候址、Algorithm::Combinatorics。這些包可以通過cpanm（建議）下載安裝
?$ sudo apt-get perlbrew install-cpanm? ? ?##獲得cpanm軟件（Ubuntu系統(tǒng)中沒有的時候需要安裝）
? ? ? ? 然后通過cpanm獲得如上的依賴包
$ cpanm BioPerl DBD::mysql DBI Parallel::ForkManager YAML::Tiny Set::Scalar Text::Table Exception::Class Test::Most Test::Warn Test::Exception Test::Deep Moose SVG Algorithm::Combinatorics
? ? ? ? ?在安裝這些perl模塊時种柑，可能會遇到報錯說模塊找不到的問題岗仑，這時候可以通過命令單獨安裝報錯的模塊，比如報錯中提到需要安裝Algorithm::Combinatorics模塊
$ cpanm?Algorithm::Combinatorics??
? ? ? ? ?但有時運行如上命令還會報錯聚请，這是需要加上 --force 參數(shù)嘗試重新安裝荠雕，或者可以直接在開始就加上 --force 參數(shù)。運行結(jié)果如下驶赏，說明安裝正確炸卑。
? ? ? ? 在安裝perl模塊時，我遇到一個xlocale.h的報錯問題母市，google之后解決了問題矾兜。
$ sed -i 's/xlocale/locale' /path/to/perl.h
? ? ? ? 還有可能遇到的幾個常見模塊安裝問題：
第一個bioperl：解決辦法 sudo apt-get install bioperl 或者 conda install perl-bioperl
第二個DBD：mysql 解決辦法 sudo apt-get install libdbd-mysql-perl 或者 conda install perl-dbd-mysql
其余模塊基本都可以用cpanm或者cpan安裝成功，如果不可以就下載源碼包make install安裝患久，或者sudo apt-get install或者conda安裝椅寺，最終都會解決perl模塊問題。
4. 安裝BLAST2（v2.2.26）蒋失、MCL及OrthMC軟件
? ? ? ?????下載編譯安裝MCL (http://www.micans.org/mcl/src/mcl-latest.tar.gz)
? ? ? ? ? ?下載編譯安裝OrthoMCL (http://orthomcl.org/common/downloads/software/v2.0/orthomclSoftware-v2.0.9.tar.gz)
? ? ? ? ? ?下載BLAST2 v2.2.26（包含blastall和formatdb）
BLAST一定要安裝v2.2.26版本返帕，我上傳到云，可以直接下載（失效的話請告知謝謝~）
鏈接: https://pan.baidu.com/s/1T7tBDFifOS7-sKKqVUC7aA 提取碼: v7ug
? ? ? ? ? ? 下載好依賴的三個軟件篙挽，將三個軟件加入環(huán)境變量并保存荆萤。
$ vim? ?~/.bashrc
在打開文件的最后一行加入路徑。
export PATH=$PATH:/path/to/blast-2.2.26/bin
export PATH=$PATH:?/usr/local/bin/mcl
export PATH=$PATH:/path/to/orthomcl/bin
修改好后保存退出铣卡，并激活環(huán)境链韭。
$ source ~/.bashrc
? ? ? ? ? ? ? ? 安裝好perl依賴模塊和依賴的blast、orthomcl工具后煮落，可以檢查依賴內(nèi)容是否齊全,運行出現(xiàn)以下內(nèi)容說明依賴內(nèi)容正確敞峭。
$ cd /path/to/orthomcl-pipline
$ perl scripts/orthomcl-pipeline-setup.pl
Checking for Software dependencies...
Checking for OthoMCL ... OK
Checking for formatdb ... OK
Checking for blastall ... OK
Checking for mcl ... OK
Wrote new configuration to orthomcl-pipeline/scripts/../etc/orthomcl-pipeline.conf
Wrote executable file to orthomcl-pipeline/scripts/../bin/orthomcl-pipeline
Please add directory orthomcl-pipeline/scripts/../bin to PATH?
? ? ? ? ? ? ? ? 5.依賴MySql數(shù)據(jù)庫配置orthomcl數(shù)據(jù)庫
? ? ? ? ? ? ? ? 配置orthomcl數(shù)據(jù)庫（MySql8.0與老版不同，建立新的用戶需要CREAT USER而不再單單是GRANT）
$?mysql -u root -p
Enter password:?
mysql> CREAT USER 'orthomcl'@'localhost' identified by 'your_password';? #設(shè)置用戶密碼
mysql> GRANT ALL PRIVILEGES on *.* to 'orthomcl'@'localhost' WITH GRANT OPTION;? #創(chuàng)建用戶并授權(quán)
mysql> quit;
? ? ? ? ? ? ? ? 建好orthomcl數(shù)據(jù)庫后用perl腳本配置蝉仇，當出現(xiàn)一下運行結(jié)果說明配置成功旋讹。
$ cd /path/to/orthomcl-pipline
$ perl?scripts/orthomcl-setup-database.pl --user orthomcl --password your_password --host localhost --database orthomcl --outfile orthomcl.conf
Connecting to mysql and creating database **orthmcldb** on host orthodb with user orthomcl ...OK
database orthmcl created ...OK
Config file **orthomcl.conf** created.
? ? ? ? ? ? ? ? 運行后腳本會生成orthomcl.conf配置文件殖蚕。
coOrthologTable=CoOrtholog
dbConnectString=dbi:mysql:orthomcl:localhost:mysql_local_infile=1
dbLogin=orthomcl
dbPassword=your_password
dbVendor=mysql
evalueExponentCutoff=-5
inParalogTable=InParalog
interTaxonMatchView=InterTaxonMatch
oracleIndexTblSpc=NONE
orthologTable=Ortholog
percentMatchCutoff=50
similarSequencesTable=SimilarSequences
? ? ? ? ? ? ? ? 6. 經(jīng)過以上依賴模塊、軟件和數(shù)據(jù)庫的配置后沉迹，就可以測試piipline是否可以正常工作了睦疫，運行perl腳本后出現(xiàn)如下內(nèi)容說明正常。
?$ cd /path/to/orthomcl-pipline
$ perl t/test_pipeline.pl -m orthomcl.conf -s fork -t /tmp
Test using scheduler fork
TESTING NON-COMPLIANT INPUT
TESTING FULL PIPELINE RUN 3
README:
Tests case of one gene (in 1.fasta and 2.fasta) not present in other files.
ok 1 - Expected matched returned groups file
...
? ? ? ? ? ? ? ? 7.終于經(jīng)過及其繁瑣的安裝鞭呕、配置和調(diào)試蛤育，我們終于可以運用orthomcl-pipline直接加入輸入文件就可以得到同源基因信息了。
運行orthomcl-pipline查看相關(guān)使用參數(shù)琅拌。
$ cd /path/to/orthomcl-pipline
$ ./bin/orthomcl-pipeline
? ? ? ? ? ? ? ? 8.示例運行
$ ./bin/orthomcl-pipeline -i /path/to/input.fasta -o /path/to/outdir -m /path/to/orthomcl.conf --nocompliant
????????其中缨伊，需要注意的地方是輸入文件必須是fasta格式的蛋白序列文件，所有軟件分析得到的結(jié)果进宝，包括聚類完成的groups文件刻坊，orthologs文件，inparalogs文件以及coorthologs文件都會輸出到輸出目錄下党晋，參數(shù) --nocompliant 表示不顯示提示信息谭胚。
? ? ? ? 在運行中可能遇到連接MySQL數(shù)據(jù)庫和similarsuquences文件過大的問題，解決辦法：
1 文件過大：修改/etc/mysql/mysql.conf.d/mysql.conf 下的[mysqld] 內(nèi)的innodb_buffer_pool_size參數(shù)改大未玻，比如改成8g灾而。
2 連接超時：登陸mysql -> SET @@GLOBAL.wait_timeout = 315360; (注意修改完不要重啟mysql，否則會恢復原始值扳剿！) -> SHOW GLOBAL VARIABLES LIKE "wait_timeout";(查看是否修改成功)
至此旁趟，利用orthomcl尋找同源基因的便捷軟件orthomcl-pipline安裝完成，orthomcl-pipline工具能在滿足使用最新版orthomcl工具分析的基礎(chǔ)上庇绽，既能省去了官方orthomcl的使用就需要13個過程的復雜步驟锡搜，通過帶入輸入文件就可以直接得到想要的信息，而且極大程度上節(jié)省了時間瞧掺，雖然安裝繁瑣耕餐，但是使用起來很方便簡單。
OrthoFinder的安裝與使用
? ? ? ? 在前面介紹過比較舊版本的但引用hin高的orthmcl之后辟狈，我們來介紹一款引用雖然沒有orthomcl那么高肠缔，但是依然熱門的程序orthofinder。OrthoFinder（文章鏈接）同樣是尋找同源基因的利器哼转，優(yōu)勢在于版本較新明未，應用方便,相關(guān)介紹可在github查看。
? ? ? ? 安裝壹蔓，直接conda安裝即可
$conda install -y orthofinder
? ? ? ? orthofinder的參數(shù)寫的很詳細亚隅，自己查看選擇即可。其中有個說明就是在比對和建樹是的e值和bootstrap的設(shè)置庶溶，可以在anaconda/bin/config.json下修改相應程序的參數(shù)煮纵，添加e值和bootstrap的值。
? ? ? ? 示例使用：
$orthofinder -f /path/to/input -t 24
$orthofinder -f /path/to/input -M msa -T iqtree -t 24?
? ? ? ? orthofinder會自動生成orthomcl格式的結(jié)果文件偏螺，除此之外還會生成單拷貝基因文件及其樹文件行疏。過程的程序選擇相比orthomcl更多樣，結(jié)果更直接套像。
? ? ? ? orthofinder的介紹很少酿联，但是安裝和使用很方便、很直觀夺巩。（強推Ｕ耆谩）
參考內(nèi)容：
快速尋找同源基因---自動化運行OrthoMCL - 簡書；
OrthoMCL 安裝配置與使用-Bluesky's blog柳譬；
MySql的官方安裝方法：https://websiteforstudents.com/install-mysql-8-0-on-ubuntu-16-04-17-10-18-04/喳张；
VMware Ubuntu安裝詳細過程（非常靠譜） - stpeace的專欄 - CSDN博客美澳；
Bioperl的安裝（一） - 高錦的博客 - CSDN博客销部；
orthomcl-pipeline/INSTALL.md at master · apetkau/orthomcl-pipeline · GitHub.
