什么是測序深度和測序覆蓋度

測序深度（depth）是指測序得到的總堿基數(shù)與待測基因組大小的比值变擒，可以理解為基因組中每個堿基被測序到的平均次數(shù)存淫。測序深度 = reads長度 × 比對的reads數(shù)目 / 參考序列長度。假設(shè)一個基因大小為2M涮阔，測序深度為10X堕澄，那么獲得的總數(shù)據(jù)量為20M瀑志。

測序覆蓋度（coverage）是指測序獲得的序列占整個基因組的比例。指的是基因組上至少被檢測到1次的區(qū)域脖阵，占整個基因組的比例皂股。由于基因組中的高GC、重復(fù)序列等復(fù)雜結(jié)構(gòu)的存在命黔，測序最終拼接組裝獲得的序列往往無法覆蓋有所的區(qū)域呜呐，這部分沒有獲得的區(qū)域就稱為Gap。例如一個細(xì)菌基因組測序悍募，覆蓋度是98%蘑辑，那么還有2%的序列區(qū)域是沒有通過測序獲得的。

在RNA-Seq的分析中坠宴，我們常用RPKM洋魂，F(xiàn)PKM和TPM作為轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)定量的表示方法，它們都是對表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的方法喜鼓，RPKM, FPKM, TPM是為了消除基因長度和測序深度的影響副砍。
在RNA-Seq的分析中，為了獲得差異表達(dá)基因庄岖，只需要對不同基因的測序Read數(shù)進(jìn)行比較即可豁翎。然而比對到不同基因上的Read數(shù)目并不能直接用于比較這兩個基因的表達(dá)量差異，因為在RNA-seq中有一個很淺顯的道理隅忿，基因越長心剥，比對到此基因上的Read就會越多；測序深度越大背桐，那么本次RNA-seq的所有Read數(shù)都會增加刘陶。也就是說Read數(shù)除了和基因表達(dá)量相關(guān)外，也和基因的長度牢撼、測序深度有關(guān)匙隔，因此為了比較多個RNA-seq重復(fù)（測序深度有一定差異）的不同基因（基因長度有一定差異）之間的表達(dá)量差異，那么就不能使用Read數(shù)直接進(jìn)行比較熏版，而是需要對Read數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化纷责。

以RPKM為例：

全名為：
Reads Per Kilobase of exon model per Million mapped reads（每千個堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的reads），主要用來對單端測序（single-end RNA-seq）進(jìn)行定量的方法撼短。
計算方式為：
RPKM = total exon reads / (mapped reads (Millions) * exon length(KB))再膳；
其中，
total exon reads：某個樣本mapping到特定基因的外顯子上的所有的reads曲横；
mapped reads (Millions) ：某個樣本的所有reads總和喂柒；
exon length(KB)：某個基因的長度（外顯子的長度的總和不瓶，以KB為單位）。

可以用這個公式計算基因灾杰，外顯子蚊丐，轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)

總結(jié)一下，RPKM的計算方法：
計算總Read數(shù)：計算每一個RNA-seq樣本的總Read數(shù)艳吠，然后將其換算為以百萬位單位（M）麦备；
標(biāo)準(zhǔn)化總Read數(shù)：將所有基因的Read數(shù)除以總Read數(shù)；
標(biāo)準(zhǔn)化基因長度：再將所有基因的Read數(shù)除以基因長度（基因長度單位為kb）

FPKM與RPKM

Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments（每千個堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的fragments）昭娩，主要是針對pair-end測序表達(dá)量進(jìn)行計算凛篙。

其實(shí)FPKM同RPKM是一樣的，只是RPKM用于單末端測序栏渺，而FPKM用于雙末端測序呛梆。
二代測序時，會將所有的DNA打成片段（fragment）磕诊，然后再去測序削彬。單末端測序時，一個片段對應(yīng)一個Read秀仲，雙末端測序時融痛，一個片段會從兩端分別測定一次，因此這兩個配對Read對應(yīng)的是同一片段（偶爾也會有一個片段只對應(yīng)一個Read的情況神僵，另一個Read因為某些原因被剔除或丟失了）雁刷。
區(qū)別也就在這里，對于FPKM來說保礼，配對到同一片段上的兩個Read只會算作一個Read沛励，也就是說FPKM是以Fragment為準(zhǔn)，不以Read數(shù)為準(zhǔn)炮障，其他計算方式是完全一樣的目派。

TPM的計算

Transcripts Per Kilobase of exon model per Million mapped reads（每千個堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的Transcripts）。
計算方式為：
TPMi = (Ni/Li) * 1000000 / sum(Ni/Li + …….. + Nm/Lm)胁赢；
Ni：mapping到基因i上的read數(shù)企蹭；
Li：基因i的外顯子長度的總和。

TPM的計算方法其實(shí)同RPKM很類似智末，同樣的對基因長度和測序深度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化谅摄，只不過RPKM是先進(jìn)行測序深度標(biāo)準(zhǔn)化，后進(jìn)行基因長度標(biāo)準(zhǔn)化系馆；而TPM是先進(jìn)行基因長度標(biāo)準(zhǔn)化送漠，后進(jìn)行測序深度標(biāo)準(zhǔn)化。事實(shí)證明由蘑，TPM的標(biāo)準(zhǔn)化方法更有優(yōu)勢闽寡。TPM可以用于同一物種不同組織間的比較代兵，因為sum值總是唯一的。

總結(jié)一下爷狈，TPM的計算方法：
標(biāo)準(zhǔn)化基因長度：將所有基因的Read數(shù)除以基因長度（基因長度單位為kb）植影；
計算總Read數(shù)：計算每一個樣本的總Read數(shù)，然后將其換算為以百萬位單位（M）淆院；
標(biāo)準(zhǔn)化總Read數(shù)：將所有基因的Read數(shù)除以總Read數(shù)何乎。

RPM/CPM

Reads/Counts of exon model per Million mapped reads (每百萬映射讀取的reads)

CPM的計算公式：
CPM = total exon reads / mapped reads (Millions)

參考：
https://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzUzMTEwODk0Ng==&mid=2247484190&idx=1&sn=e85f0e0899ad268745a481d2c82fba23&scene=21#wechat_redirect
http://www.reibang.com/p/1940c5954c81