基于二代測序的RNA癌癥研究方法

基于DNA層面的癌癥研究：一本字典
基于RNA的癌癥研究：從字典種挑取寫一篇日記
RNA特點(diǎn)：
時(shí)空特異性：需要控制變量對照組
協(xié)同作用文虏，形式多樣：表達(dá)量高低/可變剪接/單堿基突變/融合基因侣诺，mRNA/lncRNA/miRNA/ceRNA...
可控可逆，“溫和”調(diào)節(jié)：治療前后氧秘，短期發(fā)展進(jìn)程
在設(shè)置對照組應(yīng)盡量保證無環(huán)境或其他因素的干擾：如取同患者腫瘤與其癌旁組織年鸳；藥物處理時(shí)選擇同窩小鼠
重復(fù)性設(shè)置，排除隨機(jī)波動(dòng)
基因定量：FPKM/RPKM/TPM
定量方法
比對到參考轉(zhuǎn)錄組：RSEM丸相，eXpress
比對到參考基因組：cutdiff/cutffquant搔确，HTseq
不需比對（mapping free）：Sailfish，Kallisto灭忠，速度快
差異表達(dá)：foldchange膳算，pvalue
DESeq2等
不夠生物重復(fù)樣本，NOISeq
一般數(shù)目控制在百級別
功能數(shù)據(jù)庫：GO/KEGG（適合genelist）
疾病相關(guān)數(shù)據(jù)庫：OMIM/PharmGKB/GeneCards/COSMIC（適合單基因檢索）
可變剪接：轉(zhuǎn)錄后調(diào)控形式（一個(gè)基因轉(zhuǎn)錄后選擇不同外顯子區(qū)域進(jìn)行連接組合弛作，形成不同的轉(zhuǎn)錄本亞型涕蜂，并翻譯成蛋白），哺乳動(dòng)物尤為常見映琳，人95%的多外顯子基因都可能存在

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可變剪接影響：蛋白功能/活性/作用位置
癌癥研究中机隙，可變剪接結(jié)果不易理解和驗(yàn)證，不建議做結(jié)構(gòu)研究（適合三代）萨西，因此優(yōu)先級靠后
可變剪接研究方法
基于轉(zhuǎn)錄本亞型定量：同一基因不同可變剪接亞型的比例有鹿，Cutffdiff/rSeqDiff/RSEM
基于單個(gè)可變剪接事件（更常見，研究是否發(fā)生可變剪接現(xiàn)象）：外顯子跳躍原杂，內(nèi)含子保留等單個(gè)事件印颤，rMATS/DiffSplice
用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)call SNP
優(yōu)勢：更容易發(fā)現(xiàn)與功能相關(guān)的SNP
挑戰(zhàn)：基因表達(dá)豐度不同，覆蓋度極不均勻穿肄；可變剪接的存在給外顯子邊緣SNP鑒定帶來困難年局；RNA編輯干擾SNP鑒定
流程：clean reads——HISAT比對——GATK call SNP——SNP過濾
融合基因
癌癥中特異的存在际看，因基因組上的倒位、易位矢否、插入仲闽、缺失等大型結(jié)構(gòu)變異造成。原本在染色體上距離較遠(yuǎn)僵朗，或者不在同一染色體上的基因距離接近赖欣，并一同轉(zhuǎn)錄形成融合轉(zhuǎn)錄本的現(xiàn)象。
變異罕見验庙，一般只出現(xiàn)在癌癥/腫瘤組織中顶吮，是一種理想的biomarker。
癌癥中的融合基因：BCR-Abl（22chr——9Chr）粪薛，Imatinib悴了。白血病患者biomarker和藥靶

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融合基因的鑒定結(jié)果（少且易讀）：哪些基因進(jìn)行了融合，融合位置违寿，reads支持?jǐn)?shù)袭祟。易驗(yàn)證（設(shè)計(jì)PCR引物測序）

基于長讀長測序的轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)研究

轉(zhuǎn)錄本長度一般1k-5k胸蛛，二代平臺(tái)（100-150bp）覆蓋不了整條伯复∧炖＃基于短讀長RNA-seq組裝產(chǎn)生大量的嵌合體
PacBIo讀長10-40k，更利于研究可變剪接和轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)變異
基于長讀長的融合基因研究
二代測序只能確定有融合事件發(fā)生掂咒，獲得融合位置一小段區(qū)域才沧，三代可獲取完整融合轉(zhuǎn)錄本序列和融合亞型

單細(xì)胞RNA-seq的癌癥應(yīng)用

常規(guī)RNA：組織——組織勻漿，RNA提惹卫（平均化異質(zhì)性）——測序
低通量糜工，高深度單細(xì)胞技術(shù)：組織——挑選單細(xì)胞（流式細(xì)胞儀等）——單管單細(xì)胞（SMART-seq2），有偏的人為挑選录淡，每個(gè)細(xì)胞單獨(dú)建庫捌木，高深度，每個(gè)細(xì)胞能鑒定1-1.2萬基因
高通量嫉戚，低深度單細(xì)胞技術(shù)：組織——海量單細(xì)胞文庫（基于微流控系統(tǒng)刨裆，10X Genomics/MGI DNBelab C4/BioRad），一次捕獲1000-10000個(gè)細(xì)胞彬檀，每個(gè)細(xì)胞鑒定300-3000個(gè)基因帆啃，無偏
單管單細(xì)胞適合個(gè)體研究，針對同質(zhì)性群體窍帝；高通量單細(xì)胞適合群體研究努潘，針對異質(zhì)性群體
高通量單細(xì)胞：細(xì)胞分群——marker gene（只在這類細(xì)胞中表達(dá)/高表達(dá)）
空間單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組：多一維位置信息，如針對腫瘤位置相關(guān)的研究，皮膚癌/實(shí)體瘤疯坤，尚不成熟

腫瘤基因組臨床應(yīng)用專題：
【1】腫瘤醫(yī)學(xué)研究前言進(jìn)展
 【2】腫瘤基因檢測相關(guān)技術(shù)原理
 【3】腫瘤基因組數(shù)據(jù)分析方法概述
 【4】腫瘤轉(zhuǎn)錄組測序分析流程及相關(guān)軟件
 【5】腫瘤DNA甲基化數(shù)據(jù)分析原理及流程
 【6】腫瘤胚系突變遺傳分析及數(shù)據(jù)庫使用
 【7】基于NGS檢測體系變異解讀和數(shù)據(jù)庫介紹
 【8】腫瘤臨床遺傳咨詢及案例分析