Seurat4.0|| 單細胞多模態(tài)數(shù)據(jù)分析啟示錄

前情回顧

Seurat 4.0 ||單細胞數(shù)據(jù)分析工具箱有更新
 Seurat 4.0 ||單細胞多模態(tài)數(shù)據(jù)整合算法WNN
Seurat 4.0 || 分析scRNA和表面抗體數(shù)據(jù)
Seurat 4.0 || WNN整合scRNA和scATAC數(shù)據(jù)
Seurat 4.0 || 單細胞PBMC多模態(tài)參考數(shù)據(jù)集
 Seurat 4.0 || 單細胞BMNC多模態(tài)參考數(shù)據(jù)集
 Seurat教程上新||Mixscape : 用多模態(tài)單細胞數(shù)據(jù)篩選免疫檢查點

2020年10月蟀淮，紐約基因組所（ New York Genome Center ）的 Satija Lab團隊開發(fā)的單細胞分析工具Seurat升級到了4.0，其特性之一是開發(fā)了加權鄰近（weighted-nearest neighbor鸦概，WNN）算法來分析多模態(tài)數(shù)據(jù)阀蒂。所謂多模態(tài)（multimodal ）是指同時在一個細胞內(nèi)測量分屬于（廣義暖释？）中心法則不同過程的特征（如坏瞄，RNA蚂会，ATAC，膜蛋白等）作岖。直觀地說唆垃，這可以從多個側(cè)面反映細胞的真實狀態(tài)五芝，也會進一步細化我們對細胞行為與狀態(tài)的理解痘儡，這對我們研究生命發(fā)育、疾病形成的重要作用是不言而喻的枢步。我們知道沉删，如果是單一模態(tài)的數(shù)據(jù)，如RNA醉途，只是一個側(cè)面矾瑰；如果只是獨立研究，如分別研究RNA和膜蛋白隘擎，許多時候不能很好的相互解釋殴穴。在單細胞面前我們都是貪玩的孩子，不能只摸到象牙就說這是根筷子货葬。

Seurat 4.0 提出WNN是在這樣的考慮之下的采幌，重要的是目前的技術已經(jīng)允許我們同時測量多模態(tài)數(shù)據(jù)了，如CITE-seq可以同時測得RNA和表面蛋白震桶，2020年10X公司也推出了同時測RNA和ATAC的商業(yè)解決方案休傍，空轉(zhuǎn)（ST）2019年也已經(jīng)面市。數(shù)據(jù)產(chǎn)生需要新的數(shù)學框架來整合他們蹲姐。

WNN算法細節(jié)以及應用實例可以在Satija Lab團隊的（預印本）文章Integrated analysis of multimodal single-cell data中查看閱讀磨取。本文是在學習Seurat 4.0 教程之后的體會，以饗關心單細胞技術發(fā)展的華語同行柴墩。謬誤在所難免忙厌，承蒙斧正，不勝感激江咳。

不變

Seurat的框架基本是沒變的慰毅。這對單細胞數(shù)據(jù)分析來說是一件好事，因為我們遇到過糟糕的情況：除了R包名字沒變之外扎阶，一切都變了的情況汹胃。如monocle的2和3，與其說是不同版本不如說是不同的R包了东臀。熟悉Seurat v3的同行應該能夠平穩(wěn)地過渡到Seurat v4着饥。雖然引入了大量的新功能，但v3的工作流程惰赋、函數(shù)和語法宰掉，可視化方案在這次更新中基本沒有變化呵哨。此外，以前在Seurat v3中生成的Seurat對象可以無縫地裝載到Seurat v4中以進行進一步分析轨奄。

有一點提示下孟害，這幾乎是語義上的：“整合”。Seurat V3 一度被認為是整合（Integrate挪拟，CCA+MNN）不同RNA數(shù)據(jù)集的標桿工具挨务，在其文章Comprehensive Integration of Single-Cell Data中提到：Seurat v3引入了集成多個單細胞數(shù)據(jù)集的新方法。這些方法的目的是識別存在于不同數(shù)據(jù)集的共享的細胞狀態(tài)玉组，即使它們是從不同的個體谎柄、實驗條件、技術平臺甚至物種惯雳，用到的函數(shù)是FindIntegrationAnchors朝巫。業(yè)內(nèi)有不少拿它和去批次的工具在一起做benchmark，其實這不是一回事石景。強調(diào)劈猿，整合與批次不是一回事。在V4 中整合不同的RNA數(shù)據(jù)集你依然可以用‘FindIntegrationAnchors’潮孽。在V4的WNN中也有一個“整合”揪荣，這里的整合多為多模態(tài)數(shù)據(jù)之間的整合，用到的函數(shù)FindMultiModalNeighbors恩商”涮樱可見，這個函數(shù)在v3中對應的位置應該是FindNeighbors怠堪，即構建細胞間的圖結(jié)構用的部分揽乱。

我們可以用pacman包來看看新舊版本有哪些函數(shù)的變化。

packageVersion("Seurat")
[1] '3.9.9.9005'

library(pacman)
v4fun<-p_functions("Seurat")
setdiff(v4fun,v3fun) # 我存的v3的所有函數(shù)

 [1] ".__C__IntegrationAnchorSet" ".__C__ModalityWeights"      ".__C__TransferAnchorSet"    "CalcPerturbSig"            
 [5] "DEenrichRPlot"              "FindMultiModalNeighbors"    "FindSubCluster"             "FoldChange"                
 [9] "Graphs"                     "IntegrateEmbeddings"        "MappingScore"               "MapQuery"                  
[13] "MixscapeHeatmap"            "MixscapeLDA"                "NNPlot"                     "PlotPerturbScore"          
[17] "PredictAssay"               "PrepLDA"                    "ProjectUMAP"                "RunLDA"                    
[21] "RunMixscape"                "RunSPCA"

幾多

看了預印本的文章Integrated analysis of multimodal single-cell data之后覺得WNN簡直就是單細胞界的統(tǒng)一場論：可以把單細胞內(nèi)的隱藏表達矩陣都可以整合到一個Seurat對象中粟矿，偉大凰棉。但是在重現(xiàn)了V4的教程之后，特別是看到教程RNA+膜蛋白和教程RNA+ATAC是分開的之后陌粹，覺得V4沒有那么激進：不是一個教程同時整合RNA+ 膜蛋白+ ATAC+空轉(zhuǎn)撒犀。這也許不是算法上的，而是技術上的：目前還沒有技術可以這么測√椭龋現(xiàn)階段WNN的定位應該是為【scRNA+】提供解決方案或舞。

幾才算多呢？

在WNN中所謂的加權主要是給不同模態(tài)的數(shù)據(jù)以不同的權重蒙幻，比如RNA和膜蛋白中映凳，膜蛋白的權重要高一些，因為它更接近真實狀態(tài)（RNA不容易看到邮破？）诈豌。在算法中仆救，多模態(tài)數(shù)據(jù)可以看作是一個多分類的過程，如果把每一個模態(tài)看作我們對細胞的一層感知機矫渔，多模態(tài)就是多層感知機（機器學習的同行看過來）彤蔽。隨著模態(tài)的增加，就像我們提示過的：要以數(shù)據(jù)庫的思維來理解單細胞數(shù)據(jù)庙洼。

又如本文的封面所述顿痪，在單細胞技術的早期，數(shù)據(jù)分析像一本精裝書（Hardcover）很精美很細致送膳，每個技術的進步都帶來驚喜员魏。隨著數(shù)據(jù)的積累丑蛤，成本的降低叠聋，技術普及，特別是多模態(tài)技術的發(fā)展受裹，要把多模態(tài)的數(shù)據(jù)解釋清楚也就愈發(fā)需要生物學的知識碌补，此時的單細胞數(shù)據(jù)分析就像一本簡裝書（Paperback）：可能需要一個團隊來讀。這也是我們一直主張的：建立自己的單細胞數(shù)據(jù)分析團隊棉饶。

啟示錄

單細胞技術本身是在NGS技術基本成熟條件下發(fā)展出來的厦章，所以數(shù)據(jù)可以超指數(shù)增長；NGS的測序和生信大部分可以擴展到單細胞水平上照藻，所以獲得數(shù)據(jù)和分析工具并不難袜啃。單細胞數(shù)據(jù)分析可以快速入門，一如某上聯(lián)所述：降維聚類必知必會幸缕。但是群发，當我們把單細胞數(shù)據(jù)分析的物理要素（數(shù)據(jù)，服務器发乔，軟件）配齊后熟妓，我們依然面臨：數(shù)據(jù)如何挖，故事如何講的科學問題栏尚。多模態(tài)技術的發(fā)展起愈，對生物學背景提出了進一步的要求。之前的scRNA數(shù)據(jù)译仗，就是表達量咯抬虽，不管是均一化，標準化纵菌，表達量高的還是高的阐污，低的還是低的，一聚類产艾，高的和高的在一起疤剑。如果你是一個數(shù)據(jù)科學家滑绒，翻開自己工具箱，很容易去分析單細胞數(shù)：一個矩陣而已隘膘。但是疑故，RNA和ATAC可不是直接比較表達量就可以的呀，這時候弯菊，打開工具箱纵势，還需要另一個裝滿生物學問題的急救包。

一如前蘇聯(lián)百科全書式的教授柳比歇夫所比喻的：蠕蟲那么長管钳，人生啊可是那么短钦铁！在這里，我驚嘆：單細胞那么大才漆，宇宙可是那么小呀牛曹！

亞歷山大·亞歷山德羅維奇·柳比歇夫(1890年4月5日--1972年8月31日)，前蘇聯(lián)的昆蟲學家醇滥、哲學家黎比、數(shù)學家。畢業(yè)于圣彼得堡國立大學鸳玩，一生發(fā)布了70余部學術著作阅虫，從分散分析、生物分類學到昆蟲學等不跟。業(yè)余時間研究地蚤的分類颓帝，還寫過不少科學回憶錄。各種各樣的論文和專著窝革，他一共寫了五百多印張购城。五百印張，等于一萬二千五百張打字稿聊闯。即使以專業(yè)作家而論工猜，這也是個龐大的數(shù)字。他不顧政治迫害菱蔬，做了大量工作來反對和批評當時屬于蘇聯(lián)生物遺傳學主流的李森科主義篷帅。還應用數(shù)學方法來研究生物分類學。感興趣可以讀一本小書：《奇特的一生》拴泌。

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