豬苓（Polyporus umbellatus）是一種可食用的蘑菇丰介，也是我國常用的菌類藥材之一，至今已有2000多年的藥用歷史肪虎，在《神農(nóng)本草經(jīng)》劣砍、《本草綱目》、《本草求真》等典籍中均有記載扇救。豬苓具有利尿刑枝、抗菌作用香嗓，近年來研究還發(fā)現(xiàn)具有抗癌作用。當前醫(yī)藥衛(wèi)生業(yè)對豬苓的需求量逐年增加装畅。但是靠娱，豬苓的野生資源越來越少，而且種植周期較長掠兄，單產(chǎn)較低像云。豬苓具有產(chǎn)生菌核的能力，然而蚂夕，其菌核形成的分子機制尚不清楚迅诬。因此，研究豬苓的生長發(fā)育及其調(diào)控機制婿牍，發(fā)展優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的豬苓種系和栽培技術(shù)侈贷，將有助于緩解豬苓供應(yīng)緊張的問題。
2023年4月6日牍汹，中國中醫(yī)科學院中藥資源中心黃璐琦院士/袁媛研究員課題組的研究成果铐维，發(fā)表在Frontiers in Microbiology期刊上(影響因子6.064)柬泽，文章題目為“PuCRZ1, an C2H2 transcription factor from?Polyporus umbellatus, positively regulates mycelium response to osmotic stress”慎菲。該研究使用DNA親和純化測序(DAP-seq)技術(shù)鑒定了豬苓中一個C2H2轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合基序及其靶基因，揭示了PuCRZ1參與調(diào)控豬苓菌絲生長以及滲透脅迫耐受的分子機制锨并。
CRZ1（鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶反應(yīng)性鋅指轉(zhuǎn)錄因子）是C2H2家族轉(zhuǎn)錄因子露该，參與Ca2+-鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶信號通路，具有調(diào)節(jié)菌核形成第煮、維持離子穩(wěn)態(tài)和應(yīng)對脅迫等功能解幼。CRZ1同源物都具有一個或多個特征性C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域，且它們的功能和調(diào)控基因在不同物種之間存在差異包警。目前撵摆，對于擔子菌CRZ1基因的研究還很少，僅在靈芝中進行過研究害晦。
該研究首先鑒定了豬苓基因組中包含28個C2H2轉(zhuǎn)錄因子特铝。qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，其中13個基因的轉(zhuǎn)錄水平在菌絲體和菌核之間存在差異壹瘟，包括PuCRZ1鲫剿。PuCRZ1基因全長801 bp，編碼了一個包含266個氨基酸的蛋白質(zhì)稻轨，是一個核定位蛋白灵莲。
通過DAP-seq分析殴俱，鑒定到了PuCRZ1的保守結(jié)合基序為GTGGCG政冻。KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)枚抵，peak相關(guān)基因在抗生素生物合成、次級代謝產(chǎn)物生物合成明场、類固醇生物合成俄精、自噬和內(nèi)吞作用等信號通路中顯著富集，并從KEGG通路顯著富集的基因中發(fā)現(xiàn)了12個可能與豬苓菌核形成相關(guān)的基因榕堰。于是竖慧，進一步采用qRT-PCR鑒定到3個在菌絲體和菌核之間存在顯著差異表達的靶基因PuG10、PuG11逆屡、PuG12圾旨。酵母單雜交（Y1H）和凝膠阻滯實驗（EMSA）進一步驗證了PuCRZ1可以結(jié)合到PuG10、PuG11和PuG12的啟動子區(qū)域魏蔗。
在酵母中過表達PuCRZ1基因后莺治，降低了酵母細胞對NaCl和CaCl2的敏感性廓鞠。之后，通過農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化谣旁，在豬苓中分別構(gòu)建了過表達PuCRZ1床佳、PuG10、PuG11和PuG12的轉(zhuǎn)基因菌株榄审。然后砌们，分別接種到20 mM NaCl、5 mM CaCl2搁进、150 mM甘露醇培養(yǎng)基上浪感。生長30天后，觀察發(fā)現(xiàn)PuCRZ1過表達菌株在NaCl和CaCl2培養(yǎng)基中的菌落直徑小于野生型菌株（WT）饼问，表明PuCRZ1過表達菌株對Na+和Ca2+更敏感影兽。PuG10、PuG11莱革、PuG12過表達菌株在NaCl和CaCl2培養(yǎng)基中的菌落直徑無明顯差別峻堰，卻在對照培養(yǎng)基和甘露醇培養(yǎng)基上均明顯大于WT菌株，其中PuG11過表達菌株的菌落直徑最大驮吱。這表明PuCRZ1調(diào)控的三個靶基因PuG10茧妒、PuG11、PuG12均可以提高菌絲體生長速度和對甘露醇脅迫的耐受性左冬。以上結(jié)果表明PuCRZ1基因不直接調(diào)節(jié)對離子和滲透脅迫的耐受性桐筏，而是通過其靶基因?qū)γ{迫作出反應(yīng)。
此外拇砰，還發(fā)現(xiàn)PuG11基因編碼的蛋白含有FYVE結(jié)構(gòu)域梅忌，這是一種鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域狰腌。因此，該研究擴展了對真菌中含有FYVE結(jié)構(gòu)域蛋白的功能和機制的理解牧氮。
總結(jié)：該研究首次將DAP-seq技術(shù)應(yīng)用于藥用真菌的研究，為基因及分子間相互作用研究提供了新的技術(shù)借鑒踱葛。該研究揭示了PuCRZ1-鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶信號通路在豬苓菌絲體生長以及滲透脅迫耐受中起重要作用丹莲，填補了國際上對豬苓CRZ1以及含F(xiàn)YVE結(jié)構(gòu)域蛋白功能研究的空白，也為深入開展豬苓菌核形成機制的研究提供了理論依據(jù)尸诽。
論文鏈接：https://doi.org/10.3389/fmicb.2023.1131605
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