前期記錄
先確定目標(biāo)基因
CRISPR/Cas9基因敲除實驗全記錄（1）
然后對目的基因進(jìn)行背景調(diào)查
CRISPR/Cas9基因敲除實驗全記錄（2）磨刀不誤砍柴工
設(shè)計sgRNA及引物
CRISPR-Cas9（三）--sgRNA設(shè)計好之后
CRISPR/Cas9基因敲除實驗全記錄（3）sgRNA及引物設(shè)計
CRISPR/Cas9基因敲除實驗全記錄（4）構(gòu)建sgRNA+Cas9載體
轉(zhuǎn)染驗證
CRISPR/Cas9基因敲除實驗全記錄（5）293FT細(xì)胞轉(zhuǎn)染驗證 and trouble shooting
事實上，在轉(zhuǎn)染驗證結(jié)束后诞外，對于癌細(xì)胞等易轉(zhuǎn)染細(xì)胞系眯杏，基本上可以立刻進(jìn)行轉(zhuǎn)染拆讯，如果載體帶有熒光卤恳，則根據(jù)熒光篩選陽性細(xì)胞秸歧，若載體為抗生素抗性灾锯，而經(jīng)過抗生素篩選后可直接進(jìn)行下一步單克隆細(xì)胞篩選。對于難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系绰垂，可使用電轉(zhuǎn)或者特殊的轉(zhuǎn)染試劑室奏，再根據(jù)熒光或者抗性篩選。
將細(xì)胞消化過篩后種96孔板劲装，每孔種一個細(xì)胞胧沫，前提是要有活細(xì)胞工作站，可以定時拍照1星期以上酱畅，從而確定單細(xì)胞克隆琳袄，如果沒有這樣的儀器，網(wǎng)絡(luò)上還有其他篩選單細(xì)胞的教程纺酸，比如稀釋法等等（我覺得直接種1孔1個細(xì)胞就OK窖逗，種完就找到得力的顯微鏡全孔拍攝）〔褪撸總而言之碎紊，篩選單細(xì)胞這一步依賴于實驗室平臺的條件。
我已經(jīng)在前兩周完成了轉(zhuǎn)染+熒光篩選+擴(kuò)增凍存一部分樊诺，目前種板準(zhǔn)備篩選單細(xì)胞克隆仗考。由于我養(yǎng)的細(xì)胞屬于非常難轉(zhuǎn)的細(xì)胞系，使用了特殊的轉(zhuǎn)染試劑词爬，轉(zhuǎn)染過后細(xì)胞不耐受秃嗜，熒光篩選之后更加脆弱，實驗周期相應(yīng)拉長顿膨。注意锅锨，最遲最遲在確認(rèn)轉(zhuǎn)染成功后開始訂購所需的驗證性抗體。實驗并非一個人可以完成恋沃，這和實驗室的管理必搞，補給，運營還有實驗室成員的幫助有很大的關(guān)系囊咏，每一個微小的步驟都有可能把人卡得生不如死恕洲，希望能順順利利，感恩梅割。
2019/09/03
