差異分析的套路都是差不多的庙睡，大部分設(shè)計(jì)思想都是繼承l(wèi)imma這個(gè)包吼旧，DESeq2也不例外郎嫁。

DESeq2是DESeq包的更新版本捡硅，看樣子應(yīng)該不會(huì)有DESeq3了哮内，哈哈，它的設(shè)計(jì)思想就是針對(duì)count類(lèi)型的數(shù)據(jù)壮韭。

可以是任意features的count數(shù)據(jù)北发，比如對(duì)各個(gè)基因的count，或者外顯子喷屋，或者CHIP-seq的一些feature琳拨，都可以用來(lái)做差異分析。

使用這個(gè)包也是需要三個(gè)數(shù)據(jù)：

• 表達(dá)矩陣
• 分組矩陣
• 差異比較矩陣

總結(jié)起來(lái)三個(gè)步驟屯曹，我下面會(huì)一一講解

• 重點(diǎn)就是構(gòu)造一個(gè)dds的對(duì)象狱庇，
• 然后直接用DESeq函數(shù)進(jìn)行normalization處理即可，
• 處理之后用results函數(shù)來(lái)提取差異比較結(jié)果恶耽。

讀取自己的數(shù)據(jù)

一般我們會(huì)自己讀取表達(dá)矩陣和分組信息密任，下面是一個(gè)例子：

1.  options(warn=-1)
2.  suppressMessages(library(DESeq2))
3.  suppressMessages(library(limma))
4.  suppressMessages(library(pasilla))
5.  data(pasillaGenes)
6.  exprSet=counts(pasillaGenes)
7.  head(exprSet)  ##表達(dá)矩陣如下
8.  ##             treated1fb treated2fb treated3fb untreated1fb untreated2fb
9.  ## FBgn0000003          0          0          1            0            0
10.  ## FBgn0000008         78         46         43           47           89
11.  ## FBgn0000014          2          0          0            0            0
12.  ## FBgn0000015          1          0          1            0            1
13.  ## FBgn0000017       3187       1672       1859         2445         4615
14.  ## FBgn0000018        369        150        176          288          383
15.  ##             untreated3fb untreated4fb
16.  ## FBgn0000003            0            0
17.  ## FBgn0000008           53           27
18.  ## FBgn0000014            1            0
19.  ## FBgn0000015            1            2
20.  ## FBgn0000017         2063         1711
21.  ## FBgn0000018          135          174
22.  (group_list=pasillaGenes$condition)
23.  ## [1] treated   treated   treated   untreated untreated untreated untreated
24.  ## Levels: treated untreated
25.  ##這是分組信息，7個(gè)樣本驳棱，3個(gè)處理的批什，4個(gè)未處理的對(duì)照！

第一步：構(gòu)建dds對(duì)象

那么根據(jù)這兩個(gè)數(shù)據(jù)就可以構(gòu)造dds的對(duì)象了

1.  colData <- data.frame(row.names=colnames(exprSet),  
2.  group_list=group_list
3.  )
4.  ## 這是一個(gè)復(fù)雜的方法構(gòu)造這個(gè)對(duì)象社搅！
5.  dds <-  DESeqDataSetFromMatrix(countData = exprSet,
6.  colData = colData,
7.  design =  ~ group_list)

9.  ## design 其實(shí)也是一個(gè)對(duì)象驻债，還可以通過(guò)design(dds)來(lái)繼續(xù)修改分組信息乳规，但是一般沒(méi)有必要。
10.  dds
11.  ## class: DESeqDataSet 
12.  ## dim: 14470 7 
13.  ## exptData(0):
14.  ## assays(1): counts
15.  ## rownames(14470): FBgn0000003 FBgn0000008 ... FBgn0261574
16.  ##   FBgn0261575
17.  ## rowData metadata column names(0):
18.  ## colnames(7): treated1fb treated2fb ... untreated3fb untreated4fb
19.  ## colData names(1): group_list

可以看到我們構(gòu)造的dds對(duì)象有7個(gè)樣本合呐，共14470features

從基因名可以看出暮的，是果蠅的測(cè)序數(shù)據(jù)

我們也可以直接從expressionSet這個(gè)對(duì)象構(gòu)建dds對(duì)象！

1.  library(airway)
2.  data(airway)
3.  suppressMessages(library(DESeq2))
4.  dds <-  DESeqDataSet(airway, design =  ~ cell+ dex)
5.  design(dds)  <-  ~ dex 
6.  ## 構(gòu)造好的對(duì)象還可以更改分組信息

第二步：做normalization

1.  suppressMessages(dds2 <-  DESeq(dds))  
2.  ##直接用DESeq函數(shù)即可
3.  ## 下面的代碼如果你不感興趣不需要運(yùn)行淌实，免得誤導(dǎo)你
4.  ## 就是看看normalization前面的數(shù)據(jù)分布差異
5.  rld <- rlogTransformation(dds2)  ## 得到經(jīng)過(guò)DESeq2軟件normlization的表達(dá)矩陣冻辩！
6.  exprSet_new=assay(rld)
7.  par(cex =  0.7)
8.  n.sample=ncol(exprSet)
9.  if(n.sample>40) par(cex =  0.5)
10.  cols <- rainbow(n.sample*1.2)
11.  par(mfrow=c(2,2))
12.  boxplot(exprSet, col = cols,main="expression value",las=2)
13.  boxplot(exprSet_new, col = cols,main="expression value",las=2)
14.  hist(exprSet)
15.  hist(exprSet_new)

image.png

第三步：提取差異分析結(jié)果

1.  resultsNames(dds2)
2.  ## [1] "Intercept"           "group_listtreated"   "group_listuntreated"
3.  ## 其實(shí)如果只分成了兩組，并沒(méi)有必要指定這個(gè)比較矩陣拆祈！
4.  res <- results(dds2, contrast=c("group_list","treated","untreated"))  

6.  ## 提取你想要的差異分析結(jié)果恨闪，我們這里是trt組對(duì)untrt組進(jìn)行比較
7.  resOrdered <- res[order(res$padj),]
8.  resOrdered=as.data.frame(resOrdered)
9.  head(resOrdered)
10.  ##              baseMean log2FoldChange     lfcSE      stat        pvalue
11.  ## FBgn0039155  453.2753      -4.281830 0.1919977 -22.30146 3.576174e-110
12.  ## FBgn0029167 2165.0445      -2.182745 0.1080670 -20.19807  1.017931e-90
13.  ## FBgn0035085  366.8279      -2.436860 0.1505280 -16.18875  6.054219e-59
14.  ## FBgn0029896  257.9027      -2.511257 0.1823764 -13.76964  3.881667e-43
15.  ## FBgn0034736  118.4074      -3.166392 0.2375506 -13.32933  1.562878e-40
16.  ## FBgn0040091  610.6035      -1.526400 0.1278555 -11.93848  7.457520e-33
17.  ##                      padj
18.  ## FBgn0039155 2.764025e-106
19.  ## FBgn0029167  3.933795e-87
20.  ## FBgn0035085  1.559769e-55
21.  ## FBgn0029896  7.500351e-40
22.  ## FBgn0034736  2.415897e-37
23.  ## FBgn0040091  9.606528e-30

差異分析結(jié)果很容易看懂啦！

原文來(lái)自：https://www.plob.org/article/9971.html