本文選自nature communication椎椰，https://doi.org/10.1038/s41467-019-13571-x，喜歡的朋友可以自行下載閱讀沾鳄。
不廢話慨飘，上圖。
先看一個結(jié)論：雌激素是肝臟中促轉(zhuǎn)移免疫微環(huán)境的調(diào)節(jié)劑译荞，也是治療肝轉(zhuǎn)移疾病的潛在靶點(diǎn)瓤的。
摘要：這里探討了在調(diào)節(jié)結(jié)腸癌和肺癌LM的腫瘤免疫微環(huán)境（TIME）中觀察到的一種性別二型性，其中雌性小鼠LM的髓源性抑制細(xì)胞（MDSC）和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的積聚是tnfr2依賴的吞歼，而雄性小鼠則不是圈膏。在去卵巢小鼠中，大腸癌篙骡、肺癌和胰腺癌LM明顯減少稽坤，雌二醇重建可逆轉(zhuǎn)桥帆。這與肝MDSC積聚減少、CD8+T細(xì)胞γ-干擾素（IFN-γ）和顆粒酶B生成增加以及TNFR2慎皱、IDO2老虫、TDO和SerpinB9表達(dá)水平降低有關(guān)。三苯氧胺治療可增加肝細(xì)胞毒性T細(xì)胞的積累茫多，減少結(jié)腸癌LM祈匙。
本文基于作者前期的工作基礎(chǔ)，就是發(fā)現(xiàn)了TNFR2在雌性小鼠可以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移免疫微環(huán)境從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的過程天揖。當(dāng)在雄性小鼠中評估LM時夺欲，在通過脾內(nèi)/門靜脈途徑將年齡匹配的TNFR2陰性小鼠與結(jié)腸癌MC-38細(xì)胞接種后，我們發(fā)現(xiàn)這些小鼠的肝轉(zhuǎn)移數(shù)量與WT對照組沒有顯著差異今膊。
作者在雄性小鼠中發(fā)現(xiàn)腫瘤周圍存在MDSC浸潤，但是與野生型相比斑唬，TNFR2-/-并未見明顯差異市埋，并且流式細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)MDSC在免疫細(xì)胞的比例未見改變。在雄性WT小鼠中恕刘，表達(dá)TNFR2的CD11b+Gr-1+細(xì)胞的比例（30-40%）明顯低于雌性小鼠（75-90%）缤谎。
為了進(jìn)一步探討雄性和雌性小鼠的TIME差異，首先比較了荷瘤雄性和雌性小鼠在接種MC-38細(xì)胞后7天通過脾內(nèi)/門靜脈途徑肝臟中HIC的比例積累褐着。FC顯示坷澡，從雄性小鼠收集到的HIC總數(shù)是從雌性小鼠收集到的總數(shù)的1.68倍，這可能是由于雄性肝臟的體積按比例增大含蓉。HIC免疫表型顯示频敛，雄性小鼠的G-MDSC（CD11b+Ly6GHighLy6CMid）【M-MDSC（CD11b+Ly6CHighLy6GMid）】的平均每肝比例比雌性小鼠高4倍，雌性MDSC上TNFR2的表達(dá)顯著（3倍）高于雄性MDSC馅扣，雄性和雌性小鼠肝臟中的T淋巴細(xì)胞平均數(shù)量沒有顯著差異斟赚，盡管雌性小鼠肝臟中的NK細(xì)胞數(shù)量有所增加。這些數(shù)據(jù)表明岂嗓，雄性和雌性小鼠在LM期的骨髓細(xì)胞募集可能受到不同的調(diào)節(jié)汁展。
作者進(jìn)一步研究了激素調(diào)節(jié)在調(diào)控LM相關(guān)免疫微環(huán)境中的作用.雌性C57BL/6小鼠通過手術(shù)切除卵巢（OVX）來降低循環(huán)雌激素水平。卵巢切除術(shù)后3周證實子宮重量減輕厌殉，表明生理性激素水平下降食绿。然后通過脾內(nèi)/門靜脈途徑注射MC-38或（肺癌）H-59細(xì)胞，在OVX和假手術(shù)對照小鼠中產(chǎn)生實驗性LM公罕。此外器紧，胰管腺癌（PDAC）的自發(fā)性轉(zhuǎn)移是由胰內(nèi)注射10e6 LMP細(xì)胞引起的。（選擇這些腫瘤模型是因為它們高度轉(zhuǎn)移到肝臟楼眷，代表性激素?zé)o關(guān)的組織腫瘤類型铲汪，并且在疾病的臨床過程中轉(zhuǎn)移到肝臟）15-30天后處死小鼠并計數(shù)LM熊尉。與假手術(shù)對照組相比，在所有三組中掌腰，我們觀察到OVX小鼠肝轉(zhuǎn)移的數(shù)量顯著減少狰住。石蠟包埋肝切片證實OVX小鼠LM數(shù)量和大小減少
胰腺內(nèi)注射LMP的原位腫瘤重量沒有差異。這些數(shù)據(jù)表明卵巢性激素促進(jìn)雌性小鼠結(jié)腸癌齿梁、肺癌和胰腺癌催植。
作者進(jìn)一步研究了雌激素所致的轉(zhuǎn)移是不是有器官特異性，用尾靜脈注射的方法制造實驗性肺轉(zhuǎn)移和肝轉(zhuǎn)移勺择，結(jié)果發(fā)現(xiàn)下圖创南，所以說，雌激素所致轉(zhuǎn)移具有器官特異性省核，這讓我想起了TIMP-1這個特異性肝轉(zhuǎn)移指標(biāo)稿辙。
卵巢切除并沒有降低TNFR2-/-小鼠實驗性肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生率，也沒有減少TNFR2-/-小鼠肺轉(zhuǎn)移的數(shù)量气忠，這表明肝臟中卵巢激素促進(jìn)腫瘤生長的作用可能與TNFR2信號有關(guān)邻储。
作者下一步分析了卵巢雌激素對于LM轉(zhuǎn)移的影響。在接種MC-38細(xì)胞前1周皮下植入含有17β-E2的硅橡膠膠囊的OVX小鼠笔刹，并在腫瘤接種后15天分析LM芥备。酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）證實冬耿，盡管大多數(shù)OVX小鼠的血清E2濃度低于檢測水平舌菜，但植入β-E2膠囊的OVX小鼠的血清E2濃度恢復(fù)到正常范圍。重組E2可將肝轉(zhuǎn)移瘤的數(shù)量恢復(fù)到對照水平亦镶，將其確定為對肝轉(zhuǎn)移瘤生長最關(guān)鍵的雌激素日月。
雌激素對腫瘤生長什么作用呢，作者進(jìn)一步作了MTT實驗缤骨。β-E2對MC-38沒有顯著影響爱咬，LMP或H-59細(xì)胞在任何使用濃度下或在任何時間點(diǎn)（24、48和72小時）被檢測到增殖绊起，盡管在類似條件下精拟，β-E2確實將作為陽性對照的雌激素依賴性MCF-7細(xì)胞的增殖增加到與10%FBS完全培養(yǎng)基相似的水平。
既然作者都做到這個地步了虱歪，下面就開始主角登場了蜂绎，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一種異質(zhì)性的CD11b+Ly6C+Ly6G+髓樣細(xì)胞群，它們在腫瘤生長部位發(fā)揮免疫抑制功能笋鄙，包括抑制CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）和Treg的募集师枣，基于前期實驗結(jié)果，作者進(jìn)一步看看OVX是不是抑制了MDSC的招募萧落。在接種MC-38后7d處死OVX和對照組小鼠践美，用FC和定量實時逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）分離和分析HIC洗贰。基因表達(dá)分析首先證實腫瘤浸潤性T細(xì)胞和MDSCs表達(dá)ERα陨倡。
OVX小鼠肝臟中CD11b+Ly6C+Ly6G+的積累減少了2倍敛滋，這主要是由于G-MDSC（CD11b+Ly6CMidLy6GHigh）群體的顯著減少
這些細(xì)胞都存在于微轉(zhuǎn)移的邊緣兴革，并且在OVX小鼠中顯示出減少積聚的趨勢矛缨。這對應(yīng)于相同邊緣內(nèi)CD8+T細(xì)胞數(shù)量的增加，沒有觀察到NK細(xì)胞積累的顯著差異帖旨，但我們確實觀察到雌激素缺乏小鼠CD11c+細(xì)胞積累的減少箕昭，此外，在OVX小鼠的肝臟中觀察到腫瘤相關(guān)的F4/80+巨噬細(xì)胞顯著減少解阅，已知它們在LM進(jìn)展30中起重要作用（會不會是MDSC的成熟在雌激素作用下受到了抑制）落竹。
安利一個CD11家族標(biāo)記的細(xì)胞類型：CD11a：Positive staining (normal): all leukocytes CD11B: 單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞货抄，中性粒細(xì)胞述召，NK細(xì)胞等；
CD11C：樹突細(xì)胞蟹地，單核細(xì)胞积暖，巨噬細(xì)胞，中性粒細(xì)胞怪与。
這種免疫細(xì)胞浸潤類型是不是腫瘤特異性的呢夺刑，作者分別注射了肺和胰腺細(xì)胞進(jìn)行研究。通過脾內(nèi)/門靜脈途徑給OVX小鼠注射H-59肺癌和LMP-PDAC細(xì)胞分别，并通過FC分析TIME的組成
這些數(shù)據(jù)表明雌激素是肝轉(zhuǎn)移疾病發(fā)生TIME的一個重要的多功能調(diào)節(jié)因子遍愿。在移植LMP細(xì)胞的OVX小鼠胰腺中，G-MDSC和CD8+CTL在胰腺腫瘤中的蓄積與假手術(shù)組和雌激素恢復(fù)組相比無顯著性差異.與肝臟TIME相比耘斩，我們發(fā)現(xiàn)在胰腺中幾乎沒有Ly6CHighM-MDSC的積聚沼填。在靜脈注射H-59細(xì)胞的小鼠肺中，在雌激素缺乏的情況下括授，CD8+CTL的積累沒有變化坞笙。
OVX對肺M-MDSC的積累無明顯影響，而G-MDSC在肺組織中的積累可忽略不計荚虚。這些發(fā)現(xiàn)共同揭示了荷瘤小鼠肺薛夜、胰腺和肝臟中骨髓細(xì)胞積聚的器官特異性差異。
活化的CD8+T淋巴細(xì)胞是適應(yīng)性抗腫瘤免疫反應(yīng)的主要介質(zhì)曲管，其特征是產(chǎn)生干擾素γ（IFN-γ）却邓。為了確定雌激素是否影響肝臟中T細(xì)胞的活化和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，在體外用PMA and ionomycin刺激后院水，測定了從接種MC-38的OVX和假對照小鼠肝臟中分離的CD3+CD8+T細(xì)胞中IFN-γ的水平腊徙。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示简十，與對照組相比，從OVX小鼠分離的T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ增加了2倍撬腾，表明CTLs免疫應(yīng)答增強(qiáng)螟蝙。granzyme B（GrzB）mRNA在這些細(xì)胞中的表達(dá)增加證實了FC的發(fā)現(xiàn)。由于雌激素缺乏并沒有顯著改變Foxp3+細(xì)胞的數(shù)量民傻，活化T細(xì)胞的比例增加可能導(dǎo)致這些小鼠肝臟中更有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)胰默。(為什么用PMA and ionomycin刺激：1.PKC屬于下游的TCR信號，只會誘導(dǎo)T細(xì)胞活化和增殖漓踢，因此牵署，PMA和Ionomycin的刺激后T細(xì)胞的活化和增殖能力改變，然而并不會改變T細(xì)胞的分化狀態(tài)喧半。2.TCR信號的活化會激活所有的T細(xì)胞亞群奴迅，所以當(dāng)T細(xì)胞不同亞群的增殖速率不一樣時，各個T細(xì)胞亞群的原始比例就會因為刺激而發(fā)生改變挺据。但是這種假說很難加以證明取具，因為在沒有刺激的情況下，胞內(nèi)因子很難被檢測到扁耐。3.因為TCR信號是很強(qiáng)很基礎(chǔ)的刺激暇检，研究者更加傾向于認(rèn)為所有的T細(xì)胞亞群在TCR信號刺激下的增殖速度是一致的，所以在在體外進(jìn)行PMA和Ionomycin刺激后婉称，仍然反映的是T細(xì)胞亞群在生物體體內(nèi)的原始比例块仆。)，由此可見雌激素抑制了CD8+T活化酿矢，活化T細(xì)胞的比例增加可能導(dǎo)致這些小鼠肝臟產(chǎn)生更有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)榨乎。（盲猜作者會用PD-1）
SerpinB9(GrzB的抑制劑)、吲哚胺-2瘫筐，3-雙加氧酶(IDO)和色氨酸-2，3-雙加氧酶(TDO铐姚；色氨酸分解代謝酶)是妊娠期間雌激素水平升高高度誘導(dǎo)的免疫抑制蛋白策肝，以保護(hù)發(fā)育中的胎兒免受母體同種異體T細(xì)胞的影響。這些蛋白也可以由肝細(xì)胞和腫瘤相關(guān)的樹突狀細(xì)胞表達(dá)隐绵，并與對惡性腫瘤細(xì)胞34-36的免疫耐受有關(guān)之众。我們用qRT-PCR檢測了它們在肝臟中的表達(dá)水平，并觀察到OVX小鼠SerpinB9依许、IDO2和Tdo的表達(dá)降低了2倍以上棺禾，這表明雌激素參與了它們在肝臟中的表達(dá)調(diào)節(jié)。
作者既往發(fā)現(xiàn)TNFR2是雌性小鼠肝臟中的免疫抑制調(diào)節(jié)因子(即MDSC存活和功能）峭跳，進(jìn)一步研究TNFR2的表達(dá)以及對腫瘤壞死因子-α的反應(yīng)是否受雌激素的調(diào)節(jié)膘婶。對浸潤性MDSCs和Tregs進(jìn)行分離和免疫表型分析缺前。與對照組相比，從去卵巢小鼠分離的單核細(xì)胞MDSCs(CD11b+Ly6CHighLy6GMid)和CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞中TNFR2的表達(dá)顯著降低悬襟，這可能是導(dǎo)致MDSC積聚減少和雌激素耗竭小鼠T細(xì)胞活化增加的原因衅码。
從WT雌性小鼠收集的脾細(xì)胞經(jīng)10?7Mβ-E2體外處理后，TNFR2 mRNA的表達(dá)比賦形劑處理的對照組增加了3.5倍.來自O(shè)VX小鼠的LM浸潤的Treg細(xì)胞的IDO1表達(dá)顯著降低(圖7G)脊岳，證實了一種解除調(diào)節(jié)的功能逝段。
作者還發(fā)現(xiàn)雌激素耗竭的OVX小鼠增加了DC的激活，這與更強(qiáng)大的抗腫瘤免疫是一致的割捅。
為了確定卵巢切除是否也影響肝源性MDSC的功能奶躯，從而控制T細(xì)胞的expansion，作者進(jìn)行了一項以脾臟CD3+T細(xì)胞為靶點(diǎn)的抑制試驗亿驾。發(fā)現(xiàn)巫糙，與來自O(shè)VX小鼠肝臟的MDSC共孵育的T細(xì)胞比從假手術(shù)或OVX+E2肝臟獲得的MDSC孵育的T細(xì)胞具有更好的增殖能力。這證實了肝源性MDSC的免疫抑制功能颊乘，表明雌激素剝奪不僅改變了MDSC進(jìn)入肝臟的動員参淹，而且改變了它們的抑制功能。
為了確定這些綜合作用是否降低了轉(zhuǎn)移細(xì)胞在肝臟中增殖的能力乏悄，我們測量了腫瘤細(xì)胞中Ki-67的表達(dá)浙值。總而言之檩小，這些結(jié)果強(qiáng)烈暗示雌激素參與調(diào)節(jié)多種因素开呐，包括TNFR2的表達(dá)，這些因素可以促進(jìn)肝臟的TIME规求。
既然雌激素作用這么好筐付，那么家用雌激素抑制劑會對腫瘤肝轉(zhuǎn)移起到抑制作用嗎？給小鼠注射MC-38細(xì)胞阻肿，然后每周三次皮下注射4-羥基三苯氧胺或油作為載體瓦戚。21d后處死小鼠，計數(shù)LM丛塌。在服用TMX的動物中较解，觀察到與對照組相比，LM的數(shù)量顯著減少且呈劑量依賴性赴邻。在服用Tmx的小鼠中印衔，肝臟MDSC的平均數(shù)量減少，從其肝臟提取的CTL中干擾素-γ的產(chǎn)生水平相應(yīng)增加2倍姥敛。這表明這些小鼠的抗腫瘤T細(xì)胞免疫增強(qiáng)奸焙。
全文結(jié)束，本文只是免疫相關(guān)的表型實驗，沒有牽涉到機(jī)制部分与帆，如果有興趣的同學(xué)可以進(jìn)一步探討這其中DC活化或者M(jìn)DSC動員所包含的機(jī)制問題，本文偏基礎(chǔ)鲤桥，沒有臨床數(shù)據(jù)是這篇文章最大的敗筆揍拆，如何能讓讀者覺得這篇文章是緊密聯(lián)系臨床的呢？并沒有嫂拴，本文明面有任何關(guān)于生存的圖辩恼，說明了什么呢？如果最后在他莫昔芬+PD-1在腫瘤治療中用一用的話會不會對文章有點(diǎn)提升呢米辐？歡迎批評检激、指正饺律。
安利一個自發(fā)胰腺癌肝轉(zhuǎn)移實驗：Spontaneous PDAC LM：將1×106LMP細(xì)胞植入25μLMatrigel(紐約州康寧巧颈，美國)混合25μL磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)的胰腺內(nèi)砸泛，觀察到自發(fā)性PDAC肝轉(zhuǎn)移唇礁。簡而言之勾栗，B6.129小鼠用異氟醚麻醉。局部剃須消毒后盏筐，在左上腹作1.5cm縱向切口切開腹腔围俘。將體積為50μL的冰冷Matrigel/癌細(xì)胞混合物緩慢注射到胰腺實質(zhì)的尾部，使用冰冷的27號針頭和冰冷校準(zhǔn)的注射器琢融。拔針前將針頭留在注射部位30s界牡，以防滲漏。腫瘤植入后21-30天漾抬，動物被安樂死宿亡，此時肝臟表面可見轉(zhuǎn)移灶。做肝轉(zhuǎn)移有福氣了奋蔚。
