PCR引物設(shè)計(jì)
⑴ 確定PCR產(chǎn)物片段大懈健（product length）种樱；
⑵ 確定引物所在區(qū)段；
⑶ 確定引物序列的長度范圍（primer length ）腕巡；
⑷ 確定引物Tm值（melting temperature）范圍玄坦，Tm=4（G+C）+2（A+T）。
一绘沉、PCR引物設(shè)計(jì)原則
- 引物長度以15-30bp為合適的煎楣，最常用的是18-24bp；
- 引物里面的GC含量在40-60%之間是最好的车伞；
- 引物里面的ATCG分布應(yīng)遵守隨機(jī)性择懂，避免連續(xù)出現(xiàn)4個(gè)以上的單一的堿基，尤其在引物的3端不應(yīng)該出現(xiàn)連續(xù)的G/C另玖；
- 引物要求自身不能含有互補(bǔ)序列困曙，否則這個(gè)引物自身會(huì)形成發(fā)夾一樣的二級(jí)結(jié)構(gòu)，影響PCR作用效果日矫；
- 兩個(gè)引物之間不應(yīng)該有多于4個(gè)的互補(bǔ)/同源的堿基赂弓，否則會(huì)形成引物二聚體；
- 引物的3' 端是G/C哪轿。
二盈魁、Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物
Primer Premier是由Premier公司開發(fā)的、專業(yè)用于PCR引物及雜交探針和評(píng)估的系列軟件窃诉，基本上目前引物設(shè)計(jì)都是基于Primer系列杨耙，如ncbi在線引物設(shè)計(jì)是基于Primer 3赤套。
三、引物設(shè)計(jì)步驟
①輸入序列：安裝好軟件后珊膜，首先打開軟件容握，左上角來操作，file-new-dna sequence车柠，這一項(xiàng)可以把復(fù)制的序列粘貼進(jìn)去剔氏，也可以選擇另一個(gè)file-open-dna sequence去open一個(gè)新的文件。②點(diǎn)擊Primer進(jìn)入引物設(shè)計(jì)界面竹祷。③點(diǎn)擊引物設(shè)計(jì)界面上的search按鈕進(jìn)行搜索選項(xiàng)設(shè)定谈跛。④點(diǎn)擊搜索選項(xiàng)界面上的OK按鈕可得到引物設(shè)計(jì)結(jié)果。⑤選擇分值高的引物對(duì)作為實(shí)驗(yàn)合成引物選項(xiàng)塑陵。⑥根據(jù)需要對(duì)引物進(jìn)行編輯感憾。
Primer 設(shè)計(jì)引物筆記.jpg
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