深圳華大生命科學(xué)研究院主導(dǎo)，聯(lián)合國(guó)內(nèi)外多個(gè)單位实牡，利用華大自主時(shí)空組學(xué)技術(shù)Stereo-seq，解析了在小鼠胚胎發(fā)育過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)的時(shí)空動(dòng)態(tài)變化。該小鼠胚胎發(fā)育圖譜將有助于深入探究哺乳動(dòng)物發(fā)育的機(jī)制凿菩。該成果于2022年5月4日發(fā)表于Cell床绪。

研究人員利用Stereo-seq技術(shù)建立了小鼠器官發(fā)生的時(shí)空轉(zhuǎn)錄組圖譜(mouse organogenesis spatiotemporal transcriptomic atlas, MOSTA）客情，展示了其研究應(yīng)用潛力。

#?MOSTA

MOSTA通過(guò)交互式可視化癞己，方便用戶(hù)查看和檢索小鼠胚胎各個(gè)基因在不同時(shí)期的空間表達(dá)膀斋。用戶(hù)可通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)主頁(yè)面或?qū)Ш綑冢焖佾@取研究?jī)?nèi)容梗概痹雅、時(shí)空聚類(lèi)分析結(jié)果仰担、研究技術(shù)（Stereo-seq）簡(jiǎn)介、研究中使用分析軟件及產(chǎn)生的數(shù)據(jù)資源信息绩社，同時(shí)還能直接下載研究數(shù)據(jù)及分析文件等摔蓝。

期刊：Cell?

數(shù)據(jù)編號(hào)：CNP0001543

數(shù)據(jù)庫(kù)：https://db.cngb.org/stomics/mosta/

以下是文章共同第一作者吳亮博士對(duì)此項(xiàng)研究成果的詳細(xì)解讀，讀者可結(jié)合MOSTA快速獲取文獻(xiàn)概要愉耙、研究數(shù)據(jù)贮尉、分析工具、數(shù)據(jù)可視化分析結(jié)果等關(guān)鍵信息朴沿。

研究背景

理解一個(gè)全能性干細(xì)胞受精卵是如何隨著時(shí)間和空間的變化猜谚，以精確的調(diào)控發(fā)育形成一個(gè)復(fù)雜的生物體，一直是最令人著迷的科學(xué)挑戰(zhàn)之一悯仙。近年來(lái)龄毡，單細(xì)胞組學(xué)測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，研究人員對(duì)小鼠胚胎發(fā)育過(guò)程的動(dòng)態(tài)的基因表達(dá)和調(diào)控有了非常詳盡的描述锡垄。但由于技術(shù)限制沦零，研究人員并不能準(zhǔn)確地對(duì)發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞的位置和功能進(jìn)行探索。因此货岭，發(fā)展高精度的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)路操，將是進(jìn)一步解析哺乳動(dòng)物發(fā)育中復(fù)雜性的關(guān)鍵疾渴。

目前，已有多種可以高通量地獲得組織中轉(zhuǎn)錄組原位表達(dá)信息的方法屯仗，但是這些方法在單細(xì)胞分辨率上存在明顯的劣勢(shì)搞坝，且捕獲區(qū)域有限碎乃，僅能應(yīng)用于小鼠早期的胚胎或一些發(fā)育中后期特定的組織赂弓，如大腦皮層蹬竖，無(wú)法應(yīng)用發(fā)育中后期的小鼠胚胎中秧饮，這為研究器官形成帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)摧茴。

本研究基于DNA納米球陣列芯片和原位mRNA捕獲技術(shù)赘理，建立了具有迄今最大捕獲面積（最大174.24cm2）翘紊、最靈敏的基因捕獲（1,450個(gè)UMI/100μm2）和單細(xì)胞分辨率（500nm）的Stereo-seq技術(shù)换薄，并應(yīng)用該技術(shù)解析了小鼠胚胎發(fā)育中晚期器官發(fā)生的基因空間表達(dá)模式鞠呈，繪制了器官發(fā)育的軌跡圖融师，構(gòu)建了小鼠器官發(fā)育時(shí)空轉(zhuǎn)錄組圖譜。

材料和方法

研究樣本：來(lái)自12周的C57BL/6J雌性小鼠的嗅球和大腦蚁吝；發(fā)育至第9.5天（E9.5）至第16.5天（E16.5）共8個(gè)時(shí)間點(diǎn)的小鼠胚胎旱爆。

研究策略：結(jié)合DNA 納米球陣列芯片以及原位mRNA捕獲技術(shù)，建立了具有高分辨率和大視場(chǎng)的時(shí)空轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)Stereo-seq窘茁。并利用Stereo-seq技術(shù)怀伦，構(gòu)建了從E9.5到E16.5共8個(gè)時(shí)間點(diǎn)的小鼠胚胎器官發(fā)育時(shí)空轉(zhuǎn)錄組圖譜。

研究結(jié)果

1. Stereo-seq的技術(shù)參數(shù)優(yōu)于當(dāng)前其他空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)

用于mRNA原位捕獲的Stereo-seq芯片（Stereo chip）庙曙，使用了與華大DNBSEQ測(cè)序技術(shù)相同的芯片加工工藝空镜，具有規(guī)則排列的活性點(diǎn)（Spot），每個(gè)Spot點(diǎn)的直徑約為220nm捌朴，兩個(gè)Spot點(diǎn)的中心點(diǎn)的距離為500nm吴攒。Stereo chip的制備過(guò)程和Stereo-seq技術(shù)原理如下：首先利用一段隨機(jī)合成的25nt序列作為空間坐標(biāo)（coordinate identity，CID）砂蔽，包含25nt隨機(jī)合成序列洼怔，經(jīng)過(guò)滾環(huán)擴(kuò)增復(fù)制，形成DNA納米球（DNA nanoball左驾，DNB）镣隶。DNB隨后被結(jié)合到Stereo chip上，并落入芯片中數(shù)十億規(guī)則排列的Spot上诡右。通過(guò)DNBSEQ測(cè)序儀對(duì)芯片上的DNB進(jìn)行測(cè)序（第一輪測(cè)序）安岂，獲取25nt的CID序列及對(duì)應(yīng)的空間坐標(biāo)。然后通過(guò)生化合成將CID序列與UMI分子和捕獲探針（Oligo-dT）連接帆吻，構(gòu)建成完整的捕獲芯片（圖1A域那，步驟1到步驟3）。隨后猜煮，將10μm厚度的冷凍包埋組織切片貼敷在Stereo-seq捕獲芯片的表面次员，經(jīng)過(guò)組織固定和透化败许，釋放組織中的mRNA，并被Stereo chip原位捕獲淑蔚。被捕獲的mRNA經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄合成帶有CID序列的cDNA市殷，再進(jìn)行擴(kuò)增、文庫(kù)構(gòu)建和高通量測(cè)序（第二輪測(cè)序）刹衫，測(cè)序數(shù)據(jù)分析中可通過(guò)CID序列還原mRNA分子在Stereo chip中的物理位置醋寝，進(jìn)而對(duì)應(yīng)獲得高分辨率的組織原位表達(dá)信息（圖 1A，步驟4到步驟6）带迟。

相較于目前已報(bào)道的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序技術(shù)甥桂，Stereo-seq具有最高的分辨率（500nm），同時(shí)具有最大的捕獲面積（此研究中使用的最大的芯片為200mm2邮旷，完整的可用于原位捕獲的Stereo chip最大面積做到174.24cm2；圖1B）蝇摸。而且婶肩，在相同的精度下，Stereo-seq具有更強(qiáng)和更靈敏的mRNA捕獲能力（圖1C）貌夕。

2. Stereo-seq能夠在組織層面和單細(xì)胞層面解析基因表達(dá)空間異質(zhì)性

為了進(jìn)一步評(píng)估Stereo-seq對(duì)組織中細(xì)胞構(gòu)成的空間異質(zhì)性的解析能力律歼，研究人員將Stereo-seq應(yīng)用于成年小鼠的大腦半腦冠狀切面的空間表達(dá)圖譜分析研究。在組織進(jìn)行透化前啡专，利用核酸染料進(jìn)行染色記錄险毁，并與Stereo-seq產(chǎn)出的空間轉(zhuǎn)錄組位置信息進(jìn)行對(duì)比（圖2A），顯示兩者的空間位置信息高度重疊们童，表明Stereo-seq實(shí)現(xiàn)了準(zhǔn)確的原位捕獲畔况。隨后，基于核酸染色的細(xì)胞定位慧库，對(duì)Stereo-seq轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)進(jìn)行了單細(xì)胞分割分析（cell segmentation）（圖2A跷跪、圖2B），鑒定到27個(gè)細(xì)胞類(lèi)群/亞類(lèi)齐板，包括來(lái)自不同區(qū)域的8類(lèi)興奮神經(jīng)元亞類(lèi)（excitatory neuron吵瞻，EX）、4類(lèi)表達(dá)不同神經(jīng)化學(xué)因子的抑制性神經(jīng)元亞類(lèi)（inhibitory neuron甘磨，IN）和5類(lèi)具有不同區(qū)域分布的放射狀膠質(zhì)細(xì)胞亞類(lèi)（astrocyte橡羞，Astr）（圖2C、圖2D）等济舆。

同時(shí)卿泽，研究人員也評(píng)估了Stereo-seq對(duì)組織功能區(qū)域鑒定的能力。對(duì)bin50（50×50DNB bins吗冤，25μm）的數(shù)據(jù)又厉，利用自主開(kāi)發(fā)的非監(jiān)督的SCC（spatially-constrained clustering）聚類(lèi)方法九府，進(jìn)行聚類(lèi)分析，鑒定到共20個(gè)大腦功能區(qū)覆致，包括大腦皮層的不同分層侄旬，海馬、丘腦煌妈、紋狀體等結(jié)構(gòu)及其亞結(jié)構(gòu)（圖2C）儡羔。

綜上，Stereo-seq既可以基于影像進(jìn)行細(xì)胞分割璧诵，獲取單細(xì)胞水平的空間組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)汰蜘，也可通過(guò)binning的方式，識(shí)別組織中的不同功能區(qū)域之宿。

3. 構(gòu)建小鼠胚胎器官生成空間轉(zhuǎn)錄組圖譜

研究人員利用Stereo-seq技術(shù)建立了小鼠器官發(fā)生的時(shí)空轉(zhuǎn)錄組圖譜(mouse organogenesis spatiotemporal transcriptomic atlas, MOSTA族操；https://db.cngb.org/stomics/mosta/），展示了其研究應(yīng)用潛力比被。該圖譜包含了53個(gè)矢狀切片色难，解析了小鼠胚胎發(fā)育過(guò)程中，從E9.5到E16.5間共8個(gè)時(shí)間點(diǎn)等缀，全胚胎范圍的轉(zhuǎn)錄組時(shí)空動(dòng)態(tài)變化枷莉。其中13個(gè)切片來(lái)自同一個(gè)E16.5胚胎的不同切面，構(gòu)建了胚胎發(fā)育接近終末期的三維空間轉(zhuǎn)錄組圖譜（圖3）尺迂。

通過(guò)SCC算法對(duì)每個(gè)切面的胚胎進(jìn)行聚類(lèi)分析笤妙，鑒定了與每個(gè)時(shí)間點(diǎn)相匹配的主要組織和器官，例如皮膚噪裕、骨骼蹲盘、肌肉、心臟膳音、肺等及其組織特異性的表達(dá)信息（圖3）辜限。并利用TOME（trajectories of mammalian embryogenesis）分析算法對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)的胚胎的功能器官區(qū)域構(gòu)建了發(fā)育軌跡圖（圖4）。

4. 鑒定小鼠胚胎組織中細(xì)胞類(lèi)型分布的空間異質(zhì)性

在單細(xì)胞水平上严蓖，對(duì)胚胎進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組分析薄嫡，對(duì)了解組織發(fā)育過(guò)程中的細(xì)胞命運(yùn)的動(dòng)態(tài)變化至關(guān)重要。研究人員對(duì)E16.5的小鼠胚胎颗胡，進(jìn)行了基于影像的單細(xì)胞分割毫深，將捕獲率較低的細(xì)胞進(jìn)行過(guò)濾之后，獲得了281,377個(gè)細(xì)胞毒姨，平均每個(gè)細(xì)胞有1,107個(gè)UMI以及529個(gè)基因哑蔫。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)并UMAP可視化后，得到了25種主要的細(xì)胞類(lèi)型（圖5A），包括放射狀膠質(zhì)細(xì)胞闸迷、上皮細(xì)胞嵌纲、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞腥沽、巨噬細(xì)胞等逮走。

進(jìn)一步對(duì)上皮細(xì)胞和成骨細(xì)胞進(jìn)一步分類(lèi)后，發(fā)現(xiàn)能夠鑒定到更多的細(xì)胞亞形今阳。上皮細(xì)胞可細(xì)分為毛囊細(xì)胞（Krt5+师溅、Krt17+）、肺泡II型細(xì)胞（Foxp2+盾舌、Nkx2-1+）墓臭、支氣管外分泌細(xì)胞（Scgb3a2+、S100a6+）妖谴、肺纖毛細(xì)胞（DynIrb2+窿锉、Foxj1+）、胸腺上皮細(xì)胞（Tcrg-C1+膝舅、Tbata+）等（圖5B）榆综。對(duì)成骨細(xì)胞的進(jìn)一步分群后，發(fā)現(xiàn)能夠鑒定到其逐漸形成和成熟過(guò)程铸史，包括圓形成骨細(xì)胞（Sox5+、Sox9+）怯伊、柱狀成骨細(xì)胞（Sulf1+琳轿、Robo1+）、前肥大成骨細(xì)胞（Prrx1+耿芹、FbxI7+）崭篡、早期肥大成骨細(xì)胞（Runx2+、Ibsp+）吧秕、晚期肥大成骨細(xì)胞（Spp1+琉闪、Mmp9+），以及髓核細(xì)胞（Pax1+砸彬、Fmod+）（圖5C）颠毙。

5. 背側(cè)中腦發(fā)育過(guò)程中前體細(xì)胞的空間分布異質(zhì)性

中腦具有很多非常重要的感官調(diào)控功能，如視覺(jué)砂碉、聽(tīng)力蛀蜜、運(yùn)動(dòng)以及溫度調(diào)節(jié)等。結(jié)構(gòu)上增蹭，背側(cè)中腦還存在形成上丘和下丘的層級(jí)結(jié)構(gòu)滴某。相較于大腦的其他功能區(qū)域，發(fā)育中的中腦細(xì)胞異質(zhì)性和細(xì)胞空間構(gòu)成，鮮有被系統(tǒng)地研究霎奢。研究人員對(duì)E12.5户誓、E14.5以及E16.5的小鼠胚胎中腦空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行單細(xì)胞分割、聚類(lèi)幕侠，鑒定到了包括放射狀膠質(zhì)細(xì)胞（radial glia cells帝美，RGC）、神經(jīng)母細(xì)胞（neuroblasts橙依，NeuB）证舟、膠質(zhì)母細(xì)胞（glioblast，GlioB）窗骑、γ-氨基丁酸能神經(jīng)元 (GABAergic neuron女责，GABA Neu)、谷氨酸能神經(jīng)元（glutamatergic neuron创译，Glu Neu）抵知、小膠質(zhì)細(xì)胞（microglial，Micro）等11種細(xì)胞類(lèi)型（圖6A）软族。

進(jìn)一步空間映射回背側(cè)中腦組織后刷喜，發(fā)現(xiàn)在不同胚胎時(shí)間點(diǎn)中，祖細(xì)胞（RGC）和祖細(xì)胞分化而來(lái)的NeuB立砸，GlioB存在空間分布異質(zhì)性（圖6B掖疮、圖6C）。在E12.5的小鼠胚胎中颗祝，RGC的含量最多浊闪，廣泛分布在背側(cè)中腦中，而這個(gè)階段的NeuB稀疏分布在背側(cè)中腦螺戳，而GlioB則較集中分布在背側(cè)中腦的中段以及尾側(cè)搁宾。在E14.5的小鼠胚胎中，背側(cè)中腦前端的RGC已消失倔幼，只存在于腦室區(qū)的尾側(cè)區(qū)域盖腿，NeuB和GiloB各自富集在特定的區(qū)塊，表明沿著腦室區(qū)單元的組織進(jìn)行程序化功能差異分化损同，產(chǎn)生了不同的細(xì)胞類(lèi)型翩腐。在 E16.5中，RGC進(jìn)一步減少并集中在尾端膏燃，NeuB的分布更加受限栗菜，而GlioB則在原始位置的數(shù)量增加。這些發(fā)現(xiàn)表明蹄梢，神經(jīng)發(fā)生和膠質(zhì)發(fā)生不同步疙筹，RGC的分化過(guò)程具有時(shí)空不對(duì)稱(chēng)性富俄。對(duì)這三個(gè)階段的祖細(xì)胞進(jìn)行空間擬時(shí)序分析（使用monocle 3），也證實(shí)了這些結(jié)果（圖6D~圖6F）而咆。

6. 系統(tǒng)鑒定人類(lèi)發(fā)育缺陷相關(guān)基因的時(shí)空表達(dá)特征

新生兒發(fā)育缺陷產(chǎn)生嚴(yán)重的功能問(wèn)題霍比，其影響常常在發(fā)育后期顯現(xiàn)。為探索MOSTA在解析哺乳動(dòng)物遺傳疾病尤其是發(fā)育缺陷相關(guān)疾病的能力和獨(dú)特優(yōu)勢(shì)暴备，研究人員在DDG2P（The Developmental Disorders Genotype-to-Phenotype database）數(shù)據(jù)庫(kù)收集了與出生缺陷相關(guān)的基因悠瞬，并分析它們?cè)贛OSTA中對(duì)8個(gè)時(shí)間點(diǎn)中大腦、脊髓涯捻、心臟浅妆、肝臟、肺障癌、結(jié)締組織凌外、骨骼以及肌肉8個(gè)組織器官的表達(dá)情況（圖6A），發(fā)現(xiàn)許多基因具有連鎖效應(yīng)涛浙，且可同時(shí)在多個(gè)器官表達(dá)康辑。例如，導(dǎo)致腦-肺-甲狀腺綜合征的NKX2-1基因轿亮，主要在大腦中的海馬體和皮層下結(jié)構(gòu)以及肺中表達(dá)（圖6B）疮薇；導(dǎo)致雷賓諾綜合征（Robinow Syndrome）的WNT5A表達(dá)于面部、四肢我注、生殖嵴和大腦中按咒，與疾病表型相一致。

研究人員提取小鼠胚胎的上頜區(qū)域和肢體區(qū)域的數(shù)據(jù)但骨，進(jìn)一步進(jìn)行單細(xì)胞分割和無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)励七、鑒定細(xì)胞類(lèi)型，發(fā)現(xiàn)WNT5A高表達(dá)于上頜組織中的間質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞嗽冒，而在肢體中則高表達(dá)于間質(zhì)細(xì)胞中（圖7C 、圖7D）补履，表明雷賓諾綜合征在上頜和肢體的致病機(jī)制可能不同添坊。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，WNT5A的下游調(diào)控因子MSX1在上頜骨的多種細(xì)胞類(lèi)型（包括間充質(zhì)細(xì)胞）中表達(dá)箫锤，但在肢體中僅限于間充質(zhì)細(xì)胞中贬蛙。同樣，MSX1調(diào)控活性在上頜骨的間充質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞以及肢體的間充質(zhì)細(xì)胞中更高（圖7C谚攒、圖7D）阳准。以上結(jié)果揭示了雷賓諾綜合征疾病表型潛在分子發(fā)生機(jī)制。

總結(jié)

空間原位表達(dá)信息是剖析胚胎發(fā)育的關(guān)鍵馏臭。Stereo-seq具有全轉(zhuǎn)錄組覆蓋野蝇、單細(xì)胞分辨率、高靈敏度和大視野等特性，有利于將Stereo-seq推廣應(yīng)用到更多的應(yīng)用場(chǎng)景绕沈，如研究靈長(zhǎng)類(lèi)發(fā)育锐想、癌癥等研究領(lǐng)域。未來(lái)乍狐，深圳華大生命科學(xué)研究院團(tuán)隊(duì)還將利用寡核苷酸標(biāo)記的抗體同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志赠摇，或整合染色質(zhì)開(kāi)放組分析獲得表觀遺傳信息。除了發(fā)展研究領(lǐng)域的應(yīng)用浅蚪，Stereo-seq也將被推廣應(yīng)用到更多生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域藕帜，如作為補(bǔ)充醫(yī)學(xué)成像和組織病理學(xué)數(shù)據(jù)的手段進(jìn)入常規(guī)臨床實(shí)踐。

本研究由深圳華大生命科學(xué)研究院惜傲、中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院洽故、MIT（麻省理工學(xué)院）等多個(gè)科研團(tuán)隊(duì)共同完成。陳奧操漠、廖莎收津、成夢(mèng)南、麻凱龍浊伙、吳亮撞秋、賴(lài)毅維和邱肖杰為該論文的共同第一作者，汪建嚣鄙、徐訊吻贿、劉龍奇、黎宇翔和Miguel A. Esteban為論文的共同通訊作者哑子。本研究已通過(guò)倫理審查舅列，嚴(yán)格遵循相應(yīng)法規(guī)和倫理準(zhǔn)則。

原文鏈接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/ctm2.817

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