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scATAC分析神器ArchR初探-使用ArchR計(jì)算基因活性值和標(biāo)記基因（7）
scATAC分析神器ArchR初探-scRNA-seq確定細(xì)胞類型（8）
scATAC分析神器ArchR初探-ArchR中的偽批次重復(fù)處理（9）
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scATAC分析神器ArchR初探-使用ArchR進(jìn)行足跡（14）
scATAC分析神器ArchR初探-使用ArchR進(jìn)行整合分析（15）
scATAC分析神器ArchR初探-使用ArchR進(jìn)行軌跡分析（16）

9- ArchR中的偽批次重復(fù)處理

因?yàn)閟cATAC-seq數(shù)據(jù)本質(zhì)上是二進(jìn)制的-意味著任何單個(gè)位點(diǎn)都是可訪問(wèn)的或不可訪問(wèn)的-我們經(jīng)常發(fā)現(xiàn)自己想要執(zhí)行在單個(gè)單元格上不可能進(jìn)行的分析育八。此外，我們要執(zhí)行的許多分析都需要重復(fù)進(jìn)行，以獲得具有統(tǒng)計(jì)意義的度量涡上。在單單元數(shù)據(jù)中作谚，我們通過(guò)創(chuàng)建偽批量復(fù)制來(lái)解決這些問(wèn)題配深。術(shù)語(yǔ)“ 偽批量”是指單個(gè)單元格的分組鹏漆，其中來(lái)自每個(gè)單個(gè)單元格的數(shù)據(jù)被組合成一個(gè)單個(gè)的偽樣本于购，該樣本類似于批量ATAC-seq實(shí)驗(yàn)袍睡。對(duì)于每個(gè)所需的細(xì)胞分組，ArchR都會(huì)制作多個(gè)此類偽大量樣本肋僧，因此術(shù)語(yǔ)“ 偽大量”是重復(fù)的斑胜。在此過(guò)程中的基本假設(shè)是控淡，被分組在一起的單個(gè)單元格足夠相似，因此我們無(wú)需理會(huì)它們之間的差異止潘。這些單元分組幾乎總是從對(duì)應(yīng)于已知單元類型的單個(gè)群集或群集的超集派生的掺炭。本章介紹了ArchR生成這些偽批次重復(fù)的過(guò)程。

9.1 ArchR如何進(jìn)行偽批量復(fù)制覆山？

為了創(chuàng)建偽批量復(fù)制，ArchR采用了分層優(yōu)先級(jí)方法泥栖。用戶指定（i）所需的最小和最大重復(fù)數(shù)簇宽，（ii）每個(gè)重復(fù)的最小和最大細(xì)胞數(shù)，以及（iii）如果特定組缺乏足夠的細(xì)胞來(lái)進(jìn)行所需的重復(fù)吧享，則使用的采樣率魏割。例如，采樣率為0.8意味著可以對(duì)每個(gè)單元進(jìn)行采樣而無(wú)需替換钢颂，最多可替換每個(gè)重復(fù)的單元總數(shù)的80％（這將導(dǎo)致在重復(fù)之間進(jìn)行替換采樣）钞它。在這種情況下，多個(gè)重復(fù)可能包含一些相同的單元格殊鞭，但是如果您要從缺少足夠單元格的單元組中生成偽批次重復(fù)遭垛，這是必要的犧牲。

偽批次重復(fù)生成的過(guò)程可以通過(guò)如下所示的決策樹來(lái)描述操灿。

1. 足夠多的不同樣本（至少最大數(shù)量的重復(fù)樣本）每個(gè)都具有比最小數(shù)目更多的細(xì)胞，可以以樣本感知的方式創(chuàng)建偽批量復(fù)制樣本丹锹，僅將來(lái)自同一樣本的細(xì)胞合并為一個(gè)復(fù)制樣本犹赖。
2. 一些樣本每個(gè)都有超過(guò)最小數(shù)量的單元，以樣本感知方式創(chuàng)建偽大量復(fù)制卷仑。其余所需的重復(fù)項(xiàng)是通過(guò)合并單元而不用從樣本感知偽批量中尚未表示的樣本進(jìn)行替換來(lái)創(chuàng)建的峻村。
3. 創(chuàng)建樣本感知的偽批量復(fù)制時(shí)，沒(méi)有任何樣本具有超過(guò)最小數(shù)量的單元格锡凝，但有個(gè)以上的單元格minCells * minReps粘昨。所有需要的重復(fù)通過(guò)結(jié)合細(xì)胞產(chǎn)生無(wú)需更換從在樣品無(wú)關(guān)的方式。
4. 單元分組中的單元總數(shù)少于最小單元數(shù)乘以最小重復(fù)數(shù)，但大于最小單元數(shù)除以采樣率张肾。通過(guò)采樣來(lái)創(chuàng)建最小數(shù)量的復(fù)制品芭析，而無(wú)需在單個(gè)復(fù)制品中進(jìn)行替換，而可以在多個(gè)復(fù)制品中進(jìn)行替換吞瞪，同時(shí)最大程度地減少多個(gè)偽批量復(fù)制品中存在的細(xì)胞數(shù)量馁启。
5. 單元格分組內(nèi)的單元格總數(shù)小于最小單元數(shù)除以采樣率。這意味著我們必須通過(guò)在單個(gè)副本內(nèi)以及不同副本之間進(jìn)行替換采樣來(lái)制作副本芍秆。這是最壞的情況惯疙，用戶應(yīng)謹(jǐn)慎使用下游的這些偽批量復(fù)制⊙叮可以使用該minCells參數(shù)在其他各種ArchR函數(shù)中進(jìn)行控制霉颠。

為了說(shuō)明此過(guò)程，我們將使用以下示例數(shù)據(jù)集：

Sample  Cluster1  Cluster2  Cluster3  Cluster4  Cluster5
A       800       600       900       100       75
B       1000      50        400       150       25
C       600       900       100       200       50
D       1200      500       50        50        25
E       900       100       50        150       50
F       700       200       100       100       25

我們將設(shè)置minRep = 3荆虱，maxRep = 5蒿偎，minCells = 300，maxCells = 1000怀读，和sampleRatio = 0.8诉位。

9.1.1群集1

對(duì)于Cluster1，我們有6個(gè)樣本（大于maxRep）菜枷，所有樣本均具有多個(gè)minCells單元（300個(gè)單元）不从。這說(shuō)明了上面的選項(xiàng)＃1，我們將以示例感知的方式進(jìn)行5次偽批量復(fù)制犁跪，如下所示：

Rep1 = 800 cells from SampleA
Rep2 = 1000 cells from SampleB
Rep3 = 1000 cells from SampleD
Rep4 = 900 cells from SampleE
Rep5 = 700 cells from SampleF

關(guān)于這些復(fù)制椿息，有兩點(diǎn)需要注意：（i）SampleC被省略了，因?yàn)槲覀冇凶銐蚨嗟臉颖緛?lái)進(jìn)行maxRep可感知樣本的偽批量復(fù)制坷衍，而SampleC的單元數(shù)最少寝优。（ii）SampleD只使用了1000個(gè)單元格，因?yàn)檫@是maxCells值枫耳。

9.1.2集群2

對(duì)于Cluster2乏矾，我們有3個(gè)樣本均具有多個(gè)minCells單元格，而另一些樣本則沒(méi)有迁杨。這說(shuō)明了上面的選項(xiàng)2钻心，我們將進(jìn)行以下偽批量復(fù)制：

Rep1 = 600 cells from SampleA
Rep2 = 900 cells from SampleC
Rep3 = 500 cells from SampleD
Rep4 = 350 cells [50 cells from SampleB + 100 from SampleE + 200 from SampleF]

在此示例中，Rep4是通過(guò)無(wú)須抽樣的方式以不可知的方式創(chuàng)建的铅协。

9.1.3群集3

對(duì)于Cluster3捷沸，我們只有2個(gè)樣本的minCells單元格數(shù)量多于所需數(shù)量minReps。但是狐史，如果我們合并其余樣本中的單元格痒给，則可以使用多個(gè)進(jìn)行另外的復(fù)制minCells说墨。這總共給我們提供了3個(gè)偽批量復(fù)制，并代表了上述選項(xiàng)3所示的情況苍柏。我們將進(jìn)行以下復(fù)制：

Rep1 = 900 cells from SampleA
Rep2 = 400 cells from SampleB
Rep3 = 250 cells [100 cells from SampleC + 50 from SampleD + 50 from SampleE + 50 from SampleF]

與上面的Cluster2相似尼斧，Cluster3 Rep3是通過(guò)樣本不可知的方式創(chuàng)建的，無(wú)需采樣即可在多個(gè)樣本之間進(jìn)行替換试吁。

9.1.4集群4

對(duì)于Cluster4棺棵，單元總數(shù)為750，少于minCells * minReps（900個(gè)單元）熄捍。在這種情況下烛恤，minReps至少minCells沒(méi)有某種形式的替換樣本，我們沒(méi)有足夠的單元來(lái)制作治唤。但是棒动，總細(xì)胞數(shù)仍大于minCells / sampleRatio（375個(gè)細(xì)胞）糙申，這意味著我們只需要在不同的偽大量重復(fù)樣本中進(jìn)行替換取樣宾添，而不必在單個(gè)重復(fù)樣本中進(jìn)行替換。這代表了上面選項(xiàng)4中所示的情況柜裸，因此我們將進(jìn)行以下復(fù)制：

Rep1 = 300 cells [250 unique cells + 25 cells overlapping Rep2 + 25 cells overlapping Rep3]
Rep2 = 300 cells [250 unique cells + 25 cells overlapping Rep1 + 25 cells overlapping Rep3]
Rep3 = 300 cells [250 unique cells + 25 cells overlapping Rep1 + 25 cells overlapping Rep2]

在這種情況下缕陕，ArchR將最大程度減少任何兩個(gè)偽批量復(fù)制之間重疊的單元數(shù)量。

9.1.5集群5

對(duì)于Cluster5疙挺，單元總數(shù)為250扛邑，小于minCells * minReps（900個(gè)單元）且小于minCells / sampleRatio（375個(gè)單元）。這意味著我們將不得不在每個(gè)樣本內(nèi)以及跨不同的復(fù)制品進(jìn)行替換采樣铐然，以進(jìn)行偽批量復(fù)制蔬崩。這代表了以上選項(xiàng)5中所示的最不理想的情況，因此在下游分析中使用這些偽大量復(fù)制品時(shí)應(yīng)謹(jǐn)慎搀暑。因此沥阳，我們將進(jìn)行以下復(fù)制：

Rep1 = 300 cells [250 unique cells + 25 cells overlapping Rep2 + 25 cells overlapping Rep3]
Rep2 = 300 cells [250 unique cells + 25 cells overlapping Rep1 + 25 cells overlapping Rep3]
Rep3 = 300 cells [250 unique cells + 25 cells overlapping Rep1 + 25 cells overlapping Rep2]

9.2進(jìn)行偽批量重復(fù)

在ArchR中，使用addGroupCoverages()函數(shù)進(jìn)行偽批量重復(fù)自点。此處的關(guān)鍵參數(shù)groupBy定義了應(yīng)進(jìn)行偽批量重復(fù)的組桐罕。在這里，我們使用的Clusters2是通過(guò)用上一章的scRNA-seq數(shù)據(jù)定義的細(xì)胞類型標(biāo)記簇來(lái)定義的桂敛。

projHeme4 <- addGroupCoverages(ArchRProj = projHeme3, groupBy = "Clusters2")

生成這些偽批量重復(fù)后功炮，我們現(xiàn)在可以在數(shù)據(jù)中調(diào)用峰。如前所述术唬，我們不想在所有單個(gè)像元的合并集合上調(diào)用峰薪伏，因此通過(guò)聚類或其他方式定義這些更細(xì)粒度的像元組，為調(diào)用峰提供了理想的起點(diǎn)粗仓。

參考材料：

https://www.archrproject.com/