一、概述
報告基因 (reporter gene):是一種編碼可被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因安皱，也就是說调鬓，是一個其表達產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。
? 一般的酌伊，把報告基因的編碼序列和基因表達調(diào)節(jié)序列相融合形成嵌合基因腾窝，或與其它目的基因相融合，從而利用它的表達產(chǎn)物來標定目的基因的表達調(diào)控居砖。
在基因表達調(diào)控的研究中虹脯，報告基因被廣泛應(yīng)用。如綠色熒光蛋白(GFP）和熒光素酶奏候。
熒光素酶（Luciferase）：是能夠催化不同底物氧化發(fā)光的一類酶的統(tǒng)稱循集，哺乳細胞無內(nèi)源性熒光素酶。
熒光素酶報告基因的優(yōu)點
蛋白不需要翻譯后加工蔗草，所以一旦翻譯立即產(chǎn)生報告活性咒彤。
在所有的化學發(fā)光反應(yīng)中，它的光產(chǎn)物具有最高的量子效率咒精，因而非常靈敏镶柱。另外，在宿主細胞及檢測試劑中均檢測不到背景發(fā)光模叙。
檢測快速歇拆，每個樣品只需幾秒鐘
二、實驗原理
利用熒光素酶與底物結(jié)合發(fā)生化學發(fā)光反應(yīng)的特性范咨，把感興趣的基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件克隆在螢火蟲熒光素酶基因（firefly luciferase）的上游故觅，構(gòu)建成熒光素酶報告質(zhì)粒。然后轉(zhuǎn)染細胞湖蜕，適當刺激或處理后裂解細胞逻卖，測定熒光素酶活性。通過熒光素酶活性的高低判斷刺激前后或不同刺激對感興趣的調(diào)控元件的影響昭抒。
同時，為了減少內(nèi)在的變化因素（如：培養(yǎng)細胞的數(shù)目和活力的差別，細胞轉(zhuǎn)染和裂解的效率等）對實驗準確性的影響灭返，將帶有海腎熒光素酶基因（Rinilla luciferase）的質(zhì)粒（phRL-TK）作為對照質(zhì)粒與報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細胞盗迟，提供轉(zhuǎn)錄活力的內(nèi)對照，使測試結(jié)果不受實驗條件變化的干擾熙含。在測量過程中罚缕，當加入熒光素酶檢測試劑II (LARII)時產(chǎn)生螢火蟲熒光信號，這樣先測量螢火蟲熒光素酶報告基因怎静。定量螢火蟲熒光強度之后邮弹，再在同一樣品中加入Stop & Glo? 試劑，將上述反應(yīng)淬滅蚓聘，并同時啟動海腎熒光素酶反應(yīng)腌乡，同時進行第二次測量。
三夜牡、操作程序與結(jié)果判定
A．檢測前相關(guān)試劑配制
1.? 1X PLB裂解緩沖液配制：將4×體積水或PBS加入1×體積5X PLB裂解緩沖液与纽。（使用前在室溫平衡1X 緩沖液，平衡需2-3 mins）塘装。
2.? Luciferase Assay Reagent II (LAR II) 配制：將Luciferase Assay Buffer II加入Luciferase Assay Substrate充分混合后急迂，分裝，置于-20℃避光保存蹦肴。（一次配好僚碎，分裝成小管，避免反復(fù)凍融）阴幌，使用前將配好的LAR II從-20℃拿出勺阐，并平衡至室溫（需20-30min）。
3.? Stop & Glo? Reagent配制：現(xiàn)用現(xiàn)配裂七，先將Stop & Glo? Buffer放在37度溫箱中平衡至室溫（15-30min）皆看，再將1倍體積的50X Stop & Glo? Substrate加入49倍體積的將Stop & Glo? Buffer中。
B．樣品制備
1.? 仔細地將生長培養(yǎng)基從待檢細胞孔中吸出背零。用1XPBS漂洗細胞2-3次腰吟。此過程必須仔細，并盡量將漂洗用PBS吸盡（防止細胞掉落）徙瓶。
2.? 24 孔板每孔加入100-150μl 1X PLB裂解緩沖液以覆蓋細胞毛雇，然后將24孔板置搖床振搖20-30min以保證裂解緩沖液完全裂解細胞。
C．雙熒光素酶檢測方法（Promega GLOMAX） (注：系統(tǒng)運行時請勿觸摸操作屏)
1.? 重新設(shè)定系統(tǒng)：Tools? Settings? ? Reset
2.? 雙熒光素酶檢測程序的設(shè)定：
Protocols? ? ? Run Promega Protocol? ? ? DLR-O-INJ? ? OK
3.? 將50μl LAR II加入1.5ml EP管中（專用的進口EP管）侦镇，取10μl 細胞裂解液加入裝有LAR II的1.5ml EP管中灵疮，吹打2-3次混勻（盡量不要吹出泡），置于檢測儀壳繁，點擊“Measure” 開始讀數(shù)（為螢火蟲熒光素酶反應(yīng)強度）震捣。（使用前LAR II要混勻荔棉，并平衡到室溫）
4.? 測量結(jié)束后，取出EP管蒿赢，再加入50μlStop & Glo? Reagent润樱，吹打2-3次混勻（盡量不要吹出泡），再次置于檢測儀羡棵，點擊“Measure” 開始讀數(shù)（為內(nèi)參海腎熒光素酶反應(yīng)強度）壹若。（Stop &
Glo? Reagent 現(xiàn)配現(xiàn)用，不能保存）
5. 記錄讀數(shù): 每個樣品會有3個數(shù)值：RLU1——螢火蟲熒光素酶反應(yīng)強度, RLU2——內(nèi)參海腎熒光素酶反應(yīng)強度, Ratio——RLU1/ RLU2皂冰。一般記錄Ratio 值即可店展，但RLU1 和RLU2為實際熒光強度值，可以反映細胞的轉(zhuǎn)染效率秃流，也可根據(jù)實際熒光強度來調(diào)整報告質(zhì)粒與內(nèi)參的比例赂蕴。
6. 測量完畢后，請將最后檢測的EP管取出后剔应，關(guān)閉儀器睡腿。
7. 實驗結(jié)果的處理與分析：采用雙樣本等方差t檢驗進行處理，P＜0.05為差異顯著峻贮，P＜0.01為差異極顯著席怪。
四、注意事項
1. 由于溫度對酶反應(yīng)有影響纤控，所以測定時樣品和試劑均需達到室溫后再進行測定挂捻。
2. Renilla熒光素酶檢測工作液需配制后立即使用，不可配制成工作液后長期保存船万。
3. Luciferase Assay Reagent II (LAR II)不能反復(fù)凍融刻撒，保證每次用同一批次的LAR II。配好的LAR II在-20可穩(wěn)定保存一個月耿导，在-70℃可穩(wěn)定保存一年声怔。
4. 試劑保存和使用時都應(yīng)避光。
5. 為取得最佳測定效果舱呻，測定時醋火，樣品和測定試劑混合后到測定前的時間應(yīng)盡量控制在相同時間內(nèi)（1-2秒）。
6. 使用過程中切勿接觸操作屏（程序會被終止或取消）箱吕。
7. 平時盡量不要移動儀器芥驳，防止觸摸屏走位。
