Single Cell T Cell Receptor Sequencing: Techniques and Future Challenges
單細胞T細胞受體測序：技術(shù)與挑戰(zhàn)
Abstract
T細胞的特性是能夠識別無限范圍內(nèi)的自體抗原和外來抗原。這個能力是靠胸腺發(fā)育過程中通過一種基于體細胞重組的復(fù)雜分子機制實現(xiàn)的旁赊。該機制導(dǎo)致了表面抗原受體有很多種類的群體的表達崖媚，這種受體就叫做T細胞受體（TCRs）遭铺。TCRs具有細胞特異性原朝，是T細胞的一種分子標(biāo)記荐糜，在淋巴惡性腫瘤论咏、感染性疾病钓瞭、自身免疫性疾病和腫瘤免疫學(xué)等多種背景下，TCRs被廣泛用于監(jiān)測T細胞的克隆類型（clonality）和多樣性（diversity）怨喘。在這篇綜述中津畸，我們概述了用于研究TCR指令集的策略，從基于V段識別的先鋒技術(shù)必怜，到下一代測序所引入的革命肉拓，該技術(shù)允許阿爾法鏈和貝塔鏈的高通量測序∈崆欤基于單細胞的方法將分析提高到更高的復(fù)雜性暖途，現(xiàn)在提供了對成對的alpha和beta鏈進行排序的機會。我們還討論了新的方法膏执，通過整合TCR跟蹤和mRNA單細胞測序提供了一個有價值的工具驻售，將抗原特異性與轉(zhuǎn)錄動力學(xué)聯(lián)系起來，并了解T細胞可塑性的分子機制更米。
Introduction
人類T細胞在胸腺中由造血組織的祖細胞發(fā)育而來欺栗。在它們的發(fā)育過程中，它們獲得了識別外來抗原的能力征峦，并對許多不同的病原體提供保護迟几。這種功能的靈活性是由高多態(tài)性表面受體的表達稱為T細胞受體(TCRs)。TCR由兩個不同的蛋白質(zhì)鏈組成栏笆。絕大多數(shù)的人類T細胞表達細胞組成的α和β鏈而表達了TCR組成的一個小子集γ和δ鏈类腮。αβ T細胞適應(yīng)性免疫的關(guān)鍵調(diào)解人和識別抗原在協(xié)會主要組織相容性復(fù)合體(MHC)類I和II級蛋白質(zhì)。γδ T細胞而不是MHC-restricted和參與先天反應(yīng)組織竖伯。αβT細胞代表超過90%的總T細胞群和γδT相比更加多樣化;出于這個原因,絕大多數(shù)的研究TCR的重點是αβ T細胞存哲。
編碼alpha (TCRA)和beta (TCRB)鏈的基因由多個不相鄰的基因片段組成因宇，包括TCRB基因的變量(V)七婴、多樣性(D)和連接(J)片段祟偷，以及TCRA基因的變量(V)和連接(J)片段。T細胞庫的巨大多樣性是由生殖系基因片段的隨機組合(組合多樣性combinatorial diversity)和已連接片段在連接位點的隨機添加或刪除(連接多樣性junctional diversity)產(chǎn)生的打厘。
Alpha和Beta鏈在體細胞上的V（D）J 排列修肠。(A) TCRB和TCRA位點的基因組組織和體細胞重組』Фⅲ抗原庫多樣性是通過重組步驟來保證的嵌施，該步驟逐步重新排列T細胞受體(TCR)β鏈的V、D和J段莽鸭，以及TCRα鏈的V和J段吗伤。這種變異性(組合多樣性)進一步增加或刪除核苷酸在連接位點(連接多樣性)。(B)轉(zhuǎn)錄本和轉(zhuǎn)錄本的生產(chǎn)性重排（productive arrangements）硫眨。(C) TCR的結(jié)構(gòu)足淆。TCR由兩個亞基TCR Alpha 和TCR Beta 組成，每個亞基分別位于一個恒定區(qū)域和一個負責(zé)抗原識別的可變區(qū)域礁阁。
由V(D)J結(jié)編碼的序列稱為互補決定區(qū)域3或CDR3巧号。這個序列在α鏈和β鏈中都具有最高的可變性（variability），決定了T細胞識別MHC分子所呈現(xiàn)的抗原肽的能力（Figure 1B）姥闭。隨后的異二聚體對alpha鏈和beta鏈進行配對丹鸿，進一步增加了組合變異性，估計可能的組合總數(shù)超過10e18棚品。T細胞庫是動態(tài)的靠欢，直接反映了免疫反應(yīng)的多樣性:抗原呈遞給一個幼稚的T細胞，事實上铜跑，與共刺激信號相關(guān)聯(lián)门怪，促使攜帶相同TCRs的細胞迅速克隆擴增，產(chǎn)生一批“效應(yīng)細胞”疼进⌒嚼拢抗原清除后，這些細胞作為“記憶細胞”留在血液中的數(shù)量減少了伞广〖鹈保“TCR序列的特征一直具有很大的科學(xué)價值，因為它準(zhǔn)確地描述了T細胞在多種疾病中的動態(tài)嚼锄，包括惡性腫瘤减拭、自身免疫性疾病和傳染病。
1）TCR Analysis from Pioneering Techniques to Next Generation Sequencing
TCR分析從前沿技術(shù)到高通量測序技術(shù)
利用流式細胞術(shù)和針對TCRBV亞群的單克隆抗體的組合区丑，在蛋白質(zhì)水平上進行了開拓性實驗拧粪，以解剖T細胞庫修陡。這種方法是定性和定量的，但受限于特定單克隆抗體的可用性可霎，沒有提供任何關(guān)于CDR3多樣性的信息魄鸦。第一個基于基因組的方法是基于對群體中CDR3序列長度分布的分析。這種技術(shù)被稱為免疫鏡或CDR3光譜分析癣朗，其基礎(chǔ)是利用針對不同可變片段和恒定區(qū)域的特異性引物拾因，在CDR3區(qū)域擴增TCR轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，從而獲得PCR片段的電泳分析旷余。免疫鏡比較了單個TCRBV亞科中不同長度產(chǎn)物的相對頻率绢记，該亞科在多克隆群體中呈高斯分布，而在克隆富集中呈偏態(tài)分布正卧。第一個用于在核苷酸序列水平上查詢TCR指令集的分子方法是基于傳統(tǒng)的分子克隆和Sanger測序蠢熄。這種方法提供了一個更具體的TCR曲目描述，但它不足以估計巨大的TCR多樣性炉旷。真正的突破免疫特性的曲目來自高度敏感的高通量測序技術(shù)的引入大規(guī)模并行測序數(shù)以百萬計的DNA分子,而不是單一的克隆細胞提供一個全面的知識的安排(α,β鏈,或兩者兼而有之)包括這段和完整的CDR3上序列签孔。
目前的測序技術(shù)采用從基因組DNA或cDNA開始的目標(biāo)富集步驟，既提高了靈敏度砾跃，又降低了測序成本骏啰。常用的富集策略包括多重PCR、RNA誘餌富集和5’RACE PCR抽高。多重PCR策略使用一個互補于所有可能的V段的多重正向PCR引物池和一個設(shè)計在J段(如果從基因組DNA開始)或在α和β鏈的恒定區(qū)域(如果從cDNA開始)上的反向引物池判耕。這兩種方法都有優(yōu)點和缺點。從cDNA開始的PCR富集比基因組DNA有很多優(yōu)勢:(a) PCR偽產(chǎn)物的偏倚更小翘骂，因為擴增片段不包含內(nèi)含子壁熄，因此更小;(b) cDNA分析只檢測有效排列的片段(“表達的”和鏈);(c)由于mRNA轉(zhuǎn)錄本比模板基因組DNA更豐富，因此它能夠更容易地檢測較少表達的序列碳竟〔萆ィ基于誘餌的富集利用RNA誘餌直接從DNA或RNA測序(RNA-seq)文庫中捕獲TCR序列，捕獲后再進行擴增莹桅。誘餌是特定的阿爾法和貝塔轉(zhuǎn)錄本昌执，通常是共軛的磁珠。這一過程需要很少的擴增周期诈泼，減少PCR相關(guān)偏差的潛力懂拾。
第三種方法是基于轉(zhuǎn)錄本的方法，在模板切換（template-switch）步驟之后使用5'RACE铐达。RNA由具有末端轉(zhuǎn)移酶活性的酶逆轉(zhuǎn)錄岖赋，該酶在cDNA的3 '端添加一段非模板dCTPs。含有聚g束的非模板開關(guān)寡核苷酸然后與非模板拉伸結(jié)合瓮孙，并允許逆轉(zhuǎn)錄酶切換模板并繼續(xù)擴展模板直到寡核苷酸的末端唐断。模板開關(guān)寡核苷酸包含一個通用序列选脊，所有轉(zhuǎn)錄本包括TCR鏈共享。然后脸甘，在該序列上設(shè)計的正向引物與在α和β鏈的恒定區(qū)域上設(shè)計的反向引物一起使用恳啥，以豐富TCR轉(zhuǎn)錄本擴增片段的內(nèi)容，然后可以對片段進行處理斤程，生成測序文庫角寸。
使用基因組DNA作為起始材料反而更具挑戰(zhàn)性菩混，因為富集通常是通過多重PCR進行的忿墅，但內(nèi)含子的存在和較長片段的擴增可能會引入更多的技術(shù)偏差。此外沮峡，非生產(chǎn)性的重新安排也被放大和排序疚脐，使表達的曲目的分析復(fù)雜化。這一革命性的方法首次被用于描述健康個體的TCR庫多樣性邢疙，并迅速適應(yīng)于不同病理環(huán)境(如腫瘤免疫學(xué)和自體免疫)和多種臨床應(yīng)用(如監(jiān)測造血細胞移植)中的庫分析棍弄。
由于beta鏈具有較高的多樣性，與alpha鏈相比疟游，beta鏈具有更大的組合潛力呼畸，因此一直是所有TCR序列研究的主要目標(biāo)。此外颁虐，β鏈代表T細胞的一個“獨特標(biāo)簽”:T細胞經(jīng)歷了一個稱為“等位基因排斥”的過程蛮原，導(dǎo)致只產(chǎn)生一個有效排列的β鏈基因，而兩個α鏈等位基因都可以表達另绩∪逶桑“bulk”方法的局限性在于缺乏關(guān)于α和β鏈配對的信息，而α和β鏈配對真正反映了T細胞在體內(nèi)的生物學(xué)功能笋籽，只能通過單細胞分析來實現(xiàn)蹦漠。單細胞TCR全譜分析方法主要采用兩種策略:從單細胞cDNA開始直接目標(biāo)擴增和測序，或從單細胞RNA-seq數(shù)據(jù)重建TCR车海。
2）Single Cell TCR Enrichment and Sequencing
TCR的富集及測序
第一次嘗試測序單細胞TCRα和β鏈?zhǔn)褂门cSanger測序或高通量測序相關(guān)的多重PCR策略笛园。Hans和他的同事們用多重PCR方法對浸潤人結(jié)腸癌的T淋巴細胞的異質(zhì)性進行了分析，以豐富來自同一細胞的TCR序列和一組“表型基因”侍芝。他們還實現(xiàn)了一個基于pcr的單細胞條形碼策略來匯集所有的擴增子研铆，并通過NGS對它們進行排序。條形碼是一種短核苷酸序列竭贩，它唯一地標(biāo)記細胞轉(zhuǎn)錄本蚜印，并用于追蹤mRNA轉(zhuǎn)錄本的來源。通過這種原始的方法留量，他們可以將TCR序列與具有不同功能的特定T細胞子集相關(guān)聯(lián)窄赋。一個類似的單細胞條形碼策略被用來建立高通量的方法來識別具有相同的α和βTCR序列的克隆哟冬，并應(yīng)用于乳腺癌和肺癌的腫瘤浸潤淋巴細胞。
上圖解釋：單細胞T細胞受體(TCR)測序方法綜述忆绰。直接富集和測序TCR浩峡。
在圖(A)中，單細胞TCR轉(zhuǎn)錄本通過RT反應(yīng)后的多重PCR進行富集错敢，使用一組正向引物翰灾，涵蓋所有帶注釋的V alpha 和V beta 片段，并在α和β鏈的恒定區(qū)域設(shè)計反向引物稚茅。然后通過PCR添加barcode adapter纸淮，并測序。在圖(B)中亚享，細胞通過微流體乳化裝置以及特定的RT和PCR試劑在油包水的droplets中捕獲咽块。在每個液滴中，單個細胞的TCR alpha 和 beta轉(zhuǎn)錄本都被設(shè)計在alpha和beta鏈的恒定區(qū)域上的RT引物特異性地逆轉(zhuǎn)錄欺税。利用設(shè)計在所有α和β片段上的正向引物池和設(shè)計在恒定區(qū)域上的反向引物侈沪，依次擴增cDNA。α和β引物在其5 '端包含重疊序列晚凿，通過重疊擴展機制可以合成TCRα和β融合序列亭罪。熔融分子聚集在一起，打破乳液歼秽，并通過巢式擴增和測序進一步豐富应役。從單細胞“全長”RNA測序(RNA-seq)數(shù)據(jù)重建TCR。圖(C) 用微流體設(shè)備分選或捕獲的單細胞被裂解哲银，總mRNA通過oligo dT啟動反應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄扛吞。通過模板切換機制，在轉(zhuǎn)錄本的5 '端添加一個通用序列荆责。這個序列與RT反應(yīng)中使用的dT引物共享滥比，然后在文庫制備前用于擴增cDNA。在文庫制備步驟中做院，利用轉(zhuǎn)座酶對全長cDNA進行“標(biāo)記”盲泛，然后利用轉(zhuǎn)座酶插入的標(biāo)記序列對cDNA進行擴增，并插入測序barcode接頭(AD1和AD2)键耕。然后對文庫進行排序寺滚，使用專用的生物信息學(xué)算法(TraCer、TraPes屈雄、VDJ Puzzle)從所有轉(zhuǎn)錄組中提取TCR序列村视。采用基于乳化劑的單細胞TCR測序和RNA-seq配對。圖(D) 成千上萬個平行的細胞被分成水滴中的油酒奶。裂解步驟后蚁孔，它們的mRNA被使用含有相同“cell barcode”的特定RT引物池逆轉(zhuǎn)錄奶赔，該“cell barcode”是一種獨特的分子標(biāo)識符(UMI)，用于標(biāo)記細胞轉(zhuǎn)錄組杠氢。每個引物的UMI都是不同的站刑，這使得mRNA轉(zhuǎn)錄的數(shù)字計數(shù)和T7啟動子的測序成為可能。然后通過體外轉(zhuǎn)錄擴增cDNA鼻百。擴增后的barcode RNA匯集在一起進行處理绞旅。然后利用擴增的RNA作為模板，對TCR序列進行富集温艇，并根據(jù)InDrop協(xié)議生成RNA-seq文庫因悲。在RNA-seq文庫制備過程中，RNA被片段化中贝，只有3 '端轉(zhuǎn)錄本被測序囤捻。對于TCR富集，擴增的RNA使用一組橫跨V alpha 和V beta 段的RT引物進行逆轉(zhuǎn)錄邻寿，然后使用“內(nèi)部”V alpha 和V beta 和設(shè)計在恒定區(qū)域上的引物(primers)進行擴增。在此PCR反應(yīng)中视哑，還添加了測序barcode(AD1和AD2)绣否。圖(E) 成千上萬個平行的細胞被分成油包水的液滴中（droplets）。裂解后挡毅，用oligo dT引物逆轉(zhuǎn)錄它們的mRNA蒜撮。通過template-switch機制，在轉(zhuǎn)錄本的5 '端添加含有cell barcode和UMI的primer跪呈。RT反應(yīng)后液滴破碎段磨，利用設(shè)計在dT 和 switch oligonucleotides 上的external primer，將cDNAs pooled 和擴增耗绿。然后利用擴增的全長cDNA作為模板苹支，富集TCR測序，或片段化處理误阻，生成RNA-seq文庫债蜜。TCR富集采用巢式PCR法枫弟，正向引物跨越switch oligo颅筋，反向引物設(shè)計在α和β鏈的恒定區(qū)域。然后將PCR產(chǎn)物部分片段化蔚携，加入測序接頭(AD1和AD2)精耐。
真正的突破來自于基于乳化劑的PCR技術(shù)狼速。這些技術(shù)使用的設(shè)備可以泵入水中的油狀乳劑，成千上萬的單個細胞可以被捕獲到液滴中卦停，液滴與引物和PCR試劑一起工作向胡，就像一個微型反應(yīng)室浅浮。這種方法可以大幅增加并行處理的細胞數(shù)量，并能夠生成具有代表性的單細胞和融合在一起的TCR基因文庫捷枯。其中滚秩，細胞裂解后，在每一個液滴中釋放出α和βTCR mRNA淮捆，并利用末端重疊的引物進行多重PCR逆轉(zhuǎn)錄擴增郁油。在隨后的反應(yīng)中，重疊端退火攀痊，允許每條鏈的3 '端啟動互補端3 '延伸桐腌。此步驟生成包含序列和序列的融合片段;融合片段在含有“阻斷”引物的PCR中進一步擴增，這些引物可以防止未被擴增的片段被擴增苟径。Turchaninova和他的同事應(yīng)用這項技術(shù)來描述人類血液中的T細胞庫案站，但是這種方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于包括癌癥在內(nèi)的許多研究領(lǐng)域，最近在一個超高通量平臺上重新調(diào)整棘街，允許對數(shù)百萬個細胞進行TCR配對測序蟆盐。
3）TCR Reconstruction from Single Cell RNA-seq Data
單細胞RNA-seq技術(shù)的發(fā)展也為TCR分析開辟了新的前景。到目前為止遭殉，已經(jīng)開發(fā)了許多不同的protocol石挂，主要在細胞分離方法、cDNA合成和擴增以及文庫制備步驟上有所不同险污。單細胞分離方法迅速發(fā)展在過去的幾年里從手工操作到使用微流體或emulsion-based平臺的高通量分離方法,這不僅提供了巨大的優(yōu)勢在throughput方面而且在靈敏度和準(zhǔn)確性方面由于很小的反應(yīng)量使用痹愚。所有測序方案的特點是在文庫制備前的一個逆轉(zhuǎn)錄和擴增步驟。常用的擴增步驟不同蛔糯，可通過PCR或體外轉(zhuǎn)錄進行擴增拯腮，分為兩組:基于標(biāo)記或全長cDNA測序protocol。
基于標(biāo)記的策略在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中引入“細胞條形碼”蚁飒，為“標(biāo)記”單個細胞的整個cDNA池提供了可能动壤。“標(biāo)記策略”已經(jīng)成倍地提高了通量飒箭，因為標(biāo)記的cDNAs可以在擴增和庫準(zhǔn)備過程中被匯集狼电，從而大大降低了成本和實驗時間。主要缺點是弦蹂，這些protocol在庫制備過程中由于cDNAs片段化而失去了全長轉(zhuǎn)錄本的覆蓋范圍肩碟，并且與全長策略相比具有較低的敏感性(可檢測基因的數(shù)量較少)。相反凸椿，全長策略更昂貴削祈、更耗時(每個細胞的cDNA池被獨立處理以生成單個測序庫)，但更敏感，可以提供更廣泛的信息髓抑，包括亞型咙崎、剪接和單核苷酸多態(tài)性。利用全長方法生成的單細胞RNA-seq數(shù)據(jù)提取T細胞庫和異質(zhì)性信息吨拍。來自scRNA-seq數(shù)據(jù)的全長(TCR)序列的組裝允許alpha和beta鏈序列配對(在執(zhí)行“bulk”分析時不可能)褪猛，并允許clonality信息與單個T細胞的整個轉(zhuǎn)錄組集成。這種方法也呈現(xiàn)非瑣碎的分析問題:規(guī)范化reference-based組裝方法,依賴的一致性讀到“參考”體細胞基因組實際上是有偏見的重組和突變(CDR3上是特定為每個細胞)和缺乏一個完整的“參考”基因組需要從頭組裝為基礎(chǔ)的生物信息學(xué)工具的發(fā)展羹饰。
所有可用的工具基本上都結(jié)合了基于引用的組裝(reads與帶注釋的基因片段對齊)和從頭組裝(重建CD3區(qū)域)伊滋。最早用來重建成對TCR和β鏈的工具之一被稱為TraCer (34)。為了驗證 TraCer的性能队秩，Stubbington和同事使用SMART-seq protocol和從小鼠脾臟分離的FluidigmC1系統(tǒng)(Fluidigm Corporation)生成單細胞RNA-seq數(shù)據(jù)笑旺。為了驗證所識別的克隆型，他們使用了一種實驗方法來豐富TCR序列馍资，該方法使用了一種基于pcr的多路方法筒主，從用于測序庫生成的相同cDNA開始，該方法由NGS并行測序鸟蟹。兩種策略之間的良好相關(guān)性證實了該方法的有效性乌妙。在同一篇論文中，他們將這一分析應(yīng)用于沙門氏菌感染的小鼠模型戏锹，并能夠監(jiān)測感染后擴大的克隆型冠胯。該方法的優(yōu)勢在于將TCR克隆型與特定的基因表達譜相關(guān)聯(lián)，該基因表達譜提供了對整個CD4+ T細胞群的詳細分子描述锦针，并在感染后監(jiān)測CD4+ T細胞亞群的動態(tài)。
同樣的方法也被用于分析T細胞亞群的異質(zhì)性置蜀，以解決幾個生物學(xué)問題奈搜，特別是與“腫瘤免疫”相關(guān)的問題《⒒纾“在過去的幾年里馋吗，T細胞在癌癥中的作用已經(jīng)被廣泛研究，CD8+ T細胞和CD4+ T調(diào)節(jié)細胞被廣泛描述分別在幾種癌癥中抑制或促進腫瘤進展秋秤。最近宏粤，鄭和同事利用示蹤劑對T細胞浸潤性肝癌進行了解剖。他們分析了浸潤的Treg和CD8+ T細胞的克隆富集灼卢，以了解腫瘤微環(huán)境中淋巴細胞募集的分子機制绍哎。通過對TCR表達譜的解剖，他們得出結(jié)論:Treg細胞在腫瘤中不存在克隆富集鞋真，提示從周圍招募崇堰，而CD8+ T細胞經(jīng)克隆富集，提示腫瘤內(nèi)部存在克隆活化和擴增。在相同的研究思路下海诲，陸續(xù)開發(fā)了scTCR Seq繁莹、TRAPes等工具，適用于短讀單細胞RNA-Seq文庫和VDJ Puzzle特幔，可以同時分析基因表達和TCR多樣性咨演，并在抗原特異性循環(huán)CD8+ T細胞上進行了開發(fā)和驗證。
4）New Technologies and Perspectives 新技術(shù)和展望
最近修改基于標(biāo)簽的策略的嘗試有望將來自相同細胞的RNA-seq和TCR測序結(jié)合起來蚯斯。這些方法具有極大的優(yōu)勢薄风，可以大幅增加并行處理的細胞數(shù)量，這對于描述非常罕見的T細胞群是至關(guān)重要的溉跃。
最近發(fā)表的一篇論文研究了小鼠和人類Treg細胞的T細胞庫(41)村刨。在本文中，Zemmour和同事使用不同的單細胞RNA-seq方法分析了Treg細胞的轉(zhuǎn)錄表型撰茎。他們發(fā)現(xiàn)嵌牺，Treg細胞具有廣泛的異質(zhì)性，某些高度活化的亞群似乎與T細胞的轉(zhuǎn)錄相關(guān)龄糊。他們還表明逆粹，具有相同TCR的Treg在轉(zhuǎn)錄上比具有不同抗原特異性的Treg更相似，這說明Treg可塑性受TCR成形的影響較大炫惩。為了分析TCR指令表僻弹，Zemmour和他的同事使用了一種基于乳化劑的InDrop協(xié)議(圖2D)的修改，該協(xié)議目前用于3 ' '端計數(shù)他嚷。
其中蹋绽，細胞通過微流體裝置形成油包水乳狀液被捕獲成水滴。細胞被捕獲連同裂解緩沖液筋蓖，試劑卸耘，特別是條形碼引物，啟動RT反應(yīng)粘咖。條形碼cDNAs是由上千個細胞并行合成的蚣抗。將不同細胞的逆轉(zhuǎn)錄后的cDNAs通過破碎液滴匯集在一起，利用體外轉(zhuǎn)錄進行線性擴增瓮下，然后制備測序文庫翰铡。正如本文所述，這種池策略成倍地提高了吞吐量讽坏，因為可以將數(shù)千個單元池放在一個庫中锭魔。然而，片段化步驟犧牲了所有來自mRNA 5 '端(包括CDR3區(qū)域)的信息震缭。Zemmour和他的同事們克服了這個問題赂毯，他們在線性放大后引入了一個TCR富集步驟，這個步驟使用了一個橫跨所有V和beta段的多重RT池。此步驟生成與整個轉(zhuǎn)錄組庫共享相同條形碼的TCR alpha和beta庫(圖2d)党涕。最近烦感，10x基因組公司推出了一種類似的方法，將α和β鏈測序結(jié)合起來膛堤，并行地對數(shù)千個單細胞進行轉(zhuǎn)錄組分析(圖2e)手趣。該方法采用商業(yè)化的基于乳化劑的微流控平臺(Chromium 10x)，可以生成用于單細胞RNA-seq文庫制備和TCR目標(biāo)富集和測序的擴增cDNA肥荔。通過PCR對擴增的cDNA進行TCR富集绿渣，使用設(shè)計在α和β鏈的恒定區(qū)域上的反向引物和設(shè)計在第二鏈合成過程中通過模板開關(guān)機制添加在5 '處的寡核苷酸序列上的通用正向引物。每個寡核苷酸包含一個獨特的cell barcode燕耿，用于標(biāo)記整個細胞轉(zhuǎn)錄組中符，包括TCR轉(zhuǎn)錄本。
Conclusion
T細胞受體庫分析已成為了解健康個體和多種病理條件下T細胞生物學(xué)的基本工具誉帅，目前不僅應(yīng)用于研究免疫介導(dǎo)性疾病的生物學(xué)淀散，而且還應(yīng)用于監(jiān)測治療后的免疫反應(yīng)。CD3譜分型等前沿技術(shù)已被廣泛用于提供克隆擴增的信息蚜锨，但隨著NGS技術(shù)的發(fā)展档插，在產(chǎn)量和應(yīng)用方面出現(xiàn)了真正的革命。對成千上萬個細胞的TCR進行并行測序是分析T細胞反應(yīng)庫復(fù)雜性和多樣性的有力工具亚再。這項技術(shù)的主要局限在于無法配對測序和測序郭膛，這削弱了我們對體內(nèi)情況的理解。隨著單細胞技術(shù)的快速發(fā)展和擴展氛悬，這一關(guān)鍵問題最近得到了解決则剃，單細胞技術(shù)提供了配對的和單個細胞的序列信息。進一步的復(fù)雜性來自于將來自相同細胞的TCR庫和基因表達譜聯(lián)系起來的努力如捅。這種分析提供了對感興趣的種群的無偏分類忍级，以及每個細胞的轉(zhuǎn)錄景觀與其TCR之間的關(guān)聯(lián)。這種方法有望開辟新的途徑來描述免疫細胞亞群的特異性克隆性伪朽，即使是特征不明顯的表型亞群也是如此，并為監(jiān)測與克隆性密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄動力學(xué)效應(yīng)提供了機會汛蝙。
