單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組探索CRC病人的一致性
文章是：Reference component analysis of single-cell transcriptomes elucidates cellular heterogeneity in human colorectal tumors. Nat Genet 2017 May;49(5):708-718. PMID: 28319088
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組笼沥，使用的是GPL11154Illumina HiSeq 2000 (Homo sapiens) ，數(shù)據(jù)都上傳到了：GSE81861
| BioProject | PRJNA323703 |
|---|---|
| SRA | ERP016958 |
既有病人的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，同時(shí)也有細(xì)胞系的數(shù)據(jù)做驗(yàn)證。
- 1,591 single cells from 11 colorectal cancer patients，包括 969腫瘤部位細(xì)胞以及 622 癌旁細(xì)胞。嚴(yán)格過(guò)濾后只剩下：375 tumor cells and 215 normal mucosa cells
- 630 single cells from 7 cell lines，過(guò)濾后剩下561個(gè)
- 83 A549 cells,
- 65 H1437 cells,
- 55 HCT116 cells,
- 23 IMR90 cells,
- 96 K562 cells,
- 134 GM12878 cells (38 from batch 1, 96 from batch 2)
- 174 H1 cells (96 from batch 1, 78 from batch 2).
上游測(cè)序數(shù)據(jù)沒(méi)有必要重新下載分析了蝠筑，可以直接使用作者上傳的表達(dá)矩陣：
| Supplementary file | Size | Download | File type/resource |
|---|---|---|---|
| GSE81861_CRC_NM_all_cells_COUNT.csv.gz | 3.2 Mb | (ftp)(http) | CSV |
| GSE81861_CRC_NM_all_cells_FPKM.csv.gz | 4.7 Mb | (ftp)(http) | CSV |
| GSE81861_CRC_NM_epithelial_cells_COUNT.csv.gz | 2.5 Mb | (ftp)(http) | CSV |
| GSE81861_CRC_NM_epithelial_cells_FPKM.csv.gz | 4.0 Mb | (ftp)(http) | CSV |
| GSE81861_CRC_tumor_all_cells_COUNT.csv.gz | 4.3 Mb | (ftp)(http) | CSV |
| GSE81861_CRC_tumor_all_cells_FPKM.csv.gz | 7.9 Mb | (ftp)(http) | CSV |
| GSE81861_CRC_tumor_epithelial_cells_COUNT.csv.gz | 3.6 Mb | (ftp)(http) | CSV |
| GSE81861_CRC_tumor_epithelial_cells_FPKM.csv.gz | 6.5 Mb | (ftp)(http) | CSV |
| GSE81861_Cell_Line_COUNT.csv.gz | 13.1 Mb | (ftp)(http) | CSV |
| GSE81861_Cell_Line_FPKM.csv.gz | 28.9 Mb | (ftp)(http) | CSV |
| GSE81861_GEO_EGA_ID_match.csv.gz | 14.4 Kb | (ftp)(http) | CSV |
作者認(rèn)為全文最重要的是開(kāi)發(fā)了一個(gè)挖掘細(xì)胞類型的算法：reference component analysis (RCA) 優(yōu)于其它現(xiàn)有的算法】粒可以把cancer-associated fibroblasts (CAFs)繼續(xù)分成兩個(gè)類別什乙。對(duì)比的算法包括：
- hierarchical clustering using all expressed genes (All-HC)
- hierarchical clustering using principal-component analysis (PCA)-based feature selection (HiLoadG-HC)
- BackSPIN
- RaceID2
- Seurat
- three additional methods based on selection of genes with highly variable expression (VarG-HC, VarG-PCAproj-HC and VarG-tSNEproj-HC).
使用 adjusted Rand index (ARI) 指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)各個(gè)聚類算法的優(yōu)劣。結(jié)果發(fā)現(xiàn)自己開(kāi)發(fā)的RCA表現(xiàn)超常Ｒ亚颉Ｎ惹俊！
當(dāng)然了和悦，還在 Tirosh, I. et al. Dissecting the multicellular ecosystem of metastatic melanoma by single-cell RNA–seq. Science 352, 189–196 (2016). 文章的數(shù)據(jù)里面做了驗(yàn)證退疫。
背景知識(shí)
腫瘤異質(zhì)性很重要，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序很厲害鸽素，以前的研究根據(jù)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組表達(dá)矩陣進(jìn)行分類的算法不夠好褒繁，所以他們開(kāi)發(fā)reference component analysis (RCA) ， 而且 Colorectal cancer (CRC) 疾病非常嚴(yán)重馍忽，需要探索棒坏。
根據(jù)細(xì)胞系單細(xì)胞表達(dá)數(shù)據(jù)探索算法
630個(gè)細(xì)胞的表達(dá)數(shù)據(jù)，過(guò)濾后剩下561個(gè)遭笋，這里使用Fragments per kilobase per million reads (FPKM)來(lái)進(jìn)行表達(dá)定量坝冕。因?yàn)槠渖嫌翁幚碜叩氖荰OPHAT2+CUFFLINKS流程。
單細(xì)胞過(guò)濾策略
rate of exonic reads (ROER) 需要大于5%
number of detected genes (NODG) 需要大于1000瓦呼， 基因的FPKM ≥1才能算被檢測(cè)到了喂窟。
Exonic reads (ER) 要大于0.1Million
管家基因: TFRC, ACTB, RPLP0, PGK1, GAPDH, LDHA, NONO, B2M, GUSB and PPIH.
RCA算法細(xì)節(jié)
首先從 BioGPS數(shù)據(jù)庫(kù)里面下載兩個(gè)數(shù)據(jù)集： HumanU133A/GNF1H Gene Atlas and the Primary Cell Atlas ，從中挑選 A total of 4,717 genes were selected as features for GNF1H and 5,209 genes were selected for the Primary Cell Atlas. 還使用了 WGCNA 算法央串。
還使用了一些其它公共數(shù)據(jù)：TCGA, GSE14333, the PRECOG database, and GSE33113, GSE37892 and GSE39582 來(lái)驗(yàn)證單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組得到的基因集（The 'fibroblast-like' signature ）是否能顯著的區(qū)分CRC病人的生存情況磨澡。
需要了解一些細(xì)胞類型的 known markers
- epithelial cells (VIL1, KRT20, CLDN7, CDH1)
- endothelial cells (Endo; ENG)
- fibroblasts (Fibro; SPARC, COL14A, COL3A1, DCN)
- B cells (CD38, MZB1, DERL3)
- T cells (TRBC2, CD3D, CD3E, CD3G)
- myeloid cells (ITGAX, CD68, CD14, CCL3)
- mast cells (KIT, TPSB2)
做成了一個(gè)R包供使用：RCA R package, https://github.com/GIS-SP-Group/RCA.
（文章轉(zhuǎn)自jimmy的2018年閱讀文獻(xiàn)筆記）
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