qRT-PCR是一種相對表達(dá)定量的方法，他的計算方法有很多础钠，常用的相對定量數(shù)據(jù)分析方法是KJ Livak（Applied Biosystems）等人在2001年提出的“比較Ct法相對定量”，即：利用ΔCt值差異來推算基因表達(dá)差異（Ct目的基因 – Ct內(nèi)參基因 = ΔCt）贬堵，該方法的具體計算方法請參見文章：qRT-PCR相對定量計算詳解划纽。
一般在相對定量的最終結(jié)果中，樣本間的差異是以表達(dá)差異倍數(shù)（Fold change）來展現(xiàn)的瞎领，如下圖：
那么樣品間基因表達(dá)差異倍數(shù)多少則可以認(rèn)為有差異呢泌辫？回答此問題，我們需要明確差異該如何去定義九默！
如何定義差異：
說道差異大家首先想到的肯定是生物學(xué)上的差異震放，例如同一基因在兩個樣品間的表達(dá)差異倍數(shù)，一般這個倍數(shù)從1.2驼修、1.5殿遂、2倍都是可以的（轉(zhuǎn)錄組里面一般是按2倍作為篩選指標(biāo)，小編覺得1.2乙各、1.5也是可以接受的）墨礁。
另一方面，我們也應(yīng)考慮隨機誤差耳峦，因為我們無法消除誤差恩静，看上去完美的數(shù)據(jù)也有可能是隨機誤差造成的，所以蹲坷，我們在關(guān)注生物學(xué)差異之外驶乾，還要考慮統(tǒng)計學(xué)差異。
以上兩種差異都是客觀上存在的冠句，我們當(dāng)然是希望數(shù)據(jù)差異是由實驗處理造成的轻掩，但隨機誤差又是客觀存在的，所以隨機誤差發(fā)生的概率越小越好懦底。
如何衡量隨機誤差唇牧？
P值（P-value），想必大家都不會陌生聚唐，它是用來判定假設(shè)檢驗結(jié)果的一個參數(shù)丐重，說直白點就是P值代表了一種可能性，衡量的是隨機出錯的概率杆查。在統(tǒng)計學(xué)中扮惦，一般要求P值小于0.05；如果P-value=0.05亲桦，意味著我們的實驗結(jié)果有5%的概率是隨機誤差引起的崖蜜。?
我們經(jīng)常用到這樣的論述p<0.05（顯著）浊仆，可用一顆星號表示“*”，而兩顆星“**”代表p<0.01（極顯著）豫领；那是不是p<0.01的數(shù)據(jù)比p<0.05的好抡柿，組間的差異也更大呢？答案是否定的等恐！P值衡量的是隨機出錯的概率洲劣，不能衡量差異量變大小，所以我們不能說一個P值<0.01的結(jié)果比P值<0.05的結(jié)果具有更大的差異课蔬，只能說前者出錯的概率更低囱稽，或者說組間“差異有統(tǒng)計意義”，而不是組間“具有顯著的差異”二跋。
P值的計算：
P值的算法有很多種战惊，最常用的是T檢驗（T-test），亦稱student t檢驗（Student's t test）同欠，主要用于樣本含量較醒（例如n < 30），總體標(biāo)準(zhǔn)差σ未知的正態(tài)分布铺遂。T檢驗是用t分布理論來推論差異發(fā)生的概率，從而比較兩個平均數(shù)的差異是否顯著芋齿。在R語言中T檢驗用的方法為:t.test(),如果數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布怜校，也就是數(shù)據(jù)當(dāng)中有較大的離群值時忽媒，可選用非參數(shù)秩和檢驗法，如Wilcoxon test粮坞，R語言中對應(yīng)的方法為：wilcox.test()。關(guān)于數(shù)據(jù)類型及檢驗方法的選擇可參考：差異統(tǒng)計檢驗如何選擇初狰。
單樣品T檢驗
例：某魚塘水的含氧量多年平均值為4.5mg/L莫杈，現(xiàn)在該魚塘設(shè)10點采集水樣，問該次抽樣的水中含氧量與多年平均值是否有顯著差異奢入。
#數(shù)據(jù)
s<-c(4.33,4.62,3.89,4.14,4.78,4.64,4.52,4.55,4.48,4.26)
shapiro.test(s)???#如果P>0.05?符合正態(tài)分布
t.test(s,mu=4.5)??#T檢驗,?如果?P>0.05?相等
非配對兩樣本T檢驗
例：為了了解某一降血壓藥物的效果筝闹，將28名高血壓病患者隨機等分到實驗組和對照組，實驗組采用新降壓藥物腥光，對照組則用標(biāo)準(zhǔn)藥物治療关顷，測得治療前后舒張壓的差值如下。問新藥和標(biāo)準(zhǔn)藥的療效是否不同武福？
high<-c(134,146,106,119,124,161,107,83,113,129,97,123)
low<-c(70,118,101,85,107,132,94)
x<-c(high,low)
group<-c(rep("high",12),rep("low",7))
#正態(tài)性檢驗议双，wilcox.test()
shapiro.test(high)??#如果P>0.05?符合正態(tài)分布
shapiro.test(low)???#如果P>0.05?符合正態(tài)分布
#方差齊性檢驗:如果P>0.05?方差齊
bartlett.test(x~group)
#方法二：car包中l(wèi)eveneTest 檢驗，spss統(tǒng)計軟件默認(rèn)的檢驗方法
leveneTest(x~group)?
#T檢驗,?如果?P<0.05?存在差異
t.test(high,low,paired=F,var.equal=T)???#如果方差不齊捉片，可更改：var.equal=F,
#或者：
t.test(x~group,paired=F,var.equal=T)
配對兩樣本T檢驗
例：為了解DSCT冠狀動脈造影和超聲心動圖檢查兩種方法測定心臟病患者左室舒張末容積的差別平痰，某醫(yī)院收集心臟病患者12例汞舱，同時分別用兩種檢測方法測得其大小如下，問兩種檢測方法的檢測結(jié)果是否不同宗雇？
ds<-c(82.5,85.2,87.6,89.9,89.4,90.1,87.8,87.0,88.5,92.4)
cs<-c(91.7,94.2,93.3,97.0,96.4,91.5,97.2,96.2,98.5,95.8)
#方差齊性檢驗兵拢，car包中l(wèi)eveneTest
leveneTest(ds,cs)?
#作差，正態(tài)性檢驗
#差值正態(tài)性檢驗逾礁，差值符合正態(tài)分布（P>0.05）
d<-ds-cs
shapiro.test(d)
#配對T檢驗
t.test(ds,cs,paired=T,alternative="two.sided",conf.level=0.95)
統(tǒng)計檢驗及繪圖-ggpubr
ggpubr包既可以做檢驗说铃，有可以對統(tǒng)計結(jié)果進行整理繪圖，輸出結(jié)果比t檢驗更加友好嘹履。
例：兩種基因型（HH腻扇、RR）的水稻品種，分別在高氮和低氮條件下砾嫉，的測FW幼苛、DW和PH三種生理指標(biāo)數(shù)據(jù)：
women_weight?<-?c(38.9,61.2,73.3,21.8,63.4,64.6,48.4,48.8,48.5)
men_weight?<-?c(67.8,60,63.4,76,89.4,73.3,67.3,61.3,62.4)
mydata?<-?data.frame(
group=?rep(c("Woman","Man"),each=9),
weight?=?c(women_weight,??men_weight)
)
#統(tǒng)計檢驗
com1?<-?compare_means(?weight~?group?,?data?=?mydata,?method?=?"t.test")
#結(jié)果P=0.015，小于0.05焕刮，具有顯著差異：
#.y.????group1?group2??????p?p.adj?p.format?p.signif?method
#?weight?Man????Woman??0.0154?0.015?0.015????*????????T-test
繪圖顯示
install.packages("ggpubr")
library(ggpubr)
p<-?ggboxplot(mydata,?x="group",?y?="weight",?color?="group",?palette?="jco",add="jitter",short.panel.labs?=FALSE)
#?添加p值
p+?stat_compare_means(method?="t.test",label.y=100)
#?顯示p值但不顯示方法
p+?stat_compare_means(aes(label?=?..p.format..),method?="t.test",label.x?=1.5)
#?只顯示顯著性水平
p+?stat_compare_means(aes(label?=?..p.signif..),method?="t.test",label.x?=1.5)
結(jié)果圖如下：
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8.其他課程鏈接：二代測序轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)自主分析残吩、NCBI數(shù)據(jù)上傳、二代測序數(shù)據(jù)解讀倘核。
