全基因組分析造血細胞中的DNA甲基化：WGBS的DNA甲基化分析

First Online: 23 July 2017

譯者注意：文章感覺什么都沒說荒叶，也就是講一下背景，測序中的步驟蔫饰，可以了解一下，中間經(jīng)過了什么處理。

介紹

DNA甲基化是一種經(jīng)過充分研究沟沙，可遺傳和可逆的表觀遺傳修飾，對多種細胞過程至關重要绞旅。具體地驻债，DNA甲基化通過酶促機制實現(xiàn)越除，其中甲基被添加到胞嘧啶的五個位置，通常在CpG二核苷酸的情況下（圖1a）。 CpG幾乎總是甲基化，除非CpG處于高密度時崎淳，在這種情況下甲基化傾向于更低或完全不存在。雖然甲基化模式在細胞類型中相當穩(wěn)定愕把，但基因組的一些區(qū)域（例如增強子）在不同細胞和組織類型之間的甲基化水平是可變的拣凹。異常的DNA甲基化模式與許多人類疾病相關森爽，例如癌癥和神經(jīng)發(fā)育疾病。雖然啟動子和增強子中的DNA甲基化通常與基因表達的抑制相關嚣镜，但基因體中的DNA甲基化與活性轉(zhuǎn)錄正相關爬迟。全面的全基因組DNA甲基化圖譜可以揭示DNA在正常發(fā)育和疾病中的作用。因此祈惶，DNA甲基化的全基因組作圖對于表觀遺傳學研究具有重要意義雕旨。

334970_1_En_9_Fig1_HTML.gif

圖扮匠。1:（a）通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶將胞嘧啶甲基化為5-甲基胞嘧啶捧请。 （b）通過亞硫酸氫鈉轉(zhuǎn)化使胞嘧啶脫氨基。 未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶棒搜。 （c）亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化和PCR擴增后的DNA序列疹蛉。 未甲基化的胞嘧啶將被檢測為胸腺嘧啶

DNA甲基化：
    mc --- C
    C  --- T

? 高通量測序技術的發(fā)展促進了DNA甲基化的全基因組測量。 目前力麸，有三種主要測定類型的方法用于研究DNA甲基化[1]可款。 基于亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的方法，如全基因組亞硫酸氫鹽測序（WGBS）[2,3]和還原代表亞硫酸氫鹽測序克蚂，（RRBS）是目前最標準的方法[4,5]闺鲸，但甲基化arrays 和親和捕獲方法是 也用于測定甲基化差異，特別是在人類細胞中埃叭。

? 在亞硫酸氫鹽測序方法中摸恍，亞硫酸氫鈉用于將胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶（圖1b），然后在隨后的PCR和測序中將其檢測為胸腺嘧啶[6]赤屋。 相反立镶，甲基化胞嘧啶和羥甲基化胞嘧啶未經(jīng)修飾而在DNA測序過程中被鑒定為胞嘧啶（圖1c）。 亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化方法已成為以單核苷酸分辨率檢測全基因組DNA甲基化差異的非常有效的方法类早。

? 基于親和捕獲的方法媚媒，如甲基化DNA免疫沉淀測序（MeDIP-seq）[7,8]和羥甲基化DNA免疫沉淀測序（hMeDIP-seq）[9]，分別使用識別甲基胞嘧啶和羥甲基胞嘧啶的抗體來降低甲基化 和羥甲基化的基因組區(qū)域涩僻。 Cytosine 5-亞甲基磺酸鹽測序（CMS-seq）利用硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化和親和捕獲方法進行5hmC檢測[10]使用CMS特異性抗血清缭召。 最后一種方法利用基于富集的方法，如甲基化敏感的限制酶消化測序（MRE-seq）[11]逆日。

WGBS/RRBS
甲基化DNA免疫沉淀測序（MeDIP-seq）嵌巷、羥甲基化DNA免疫沉淀測序（hMeDIP-seq）
甲基化芯片

Cytosine 5-亞甲基磺酸鹽測序（CMS-seq）
甲基化敏感的限制酶消化測序（MRE-seq）

? 雖然我們將重點放在樣品制備上（圖2），但也應考慮測序深度屏富，因為這是該過程總成本的重要因素晴竞。 我們建議最低平均覆蓋率為10-15倍。 這轉(zhuǎn)換為使用當前Illumina HiSeq protocols的大約2億次讀取狠半。 然而噩死，更高的覆蓋率可以獲得更好的分辨率和檢測次要甲基化差異的能力颤难。

最低平均覆蓋率為10-15倍
大約2億次讀取

334970_1_En_9_Fig2_HTML.gif

圖2：WGBS protocol 概述。 分離的基因組DNA被片段化已维，平均大小為350bp行嗤。 將3'和5'突出端修復成鈍端，并在鈍片段的3'末端添加單個“A”垛耳。 A尾加工后栅屏，將甲基化的adapters連接到A尾片段上，并用亞硫酸氫鈉處理堂鲜。 進行最終擴增PCR并檢查文庫質(zhì)量栈雳。

? 最后，發(fā)現(xiàn)5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）作為一種具有5mC潛在不同性質(zhì)的DNA甲基化缔莲，增加了對該標記檢測的興趣哥纫。 重要的是，亞硫酸氫鹽測序方法不能區(qū)分5mC和5hmC痴奏，因為用任一標記修飾的胞嘧啶都不受亞硫酸氫鹽的影響蛀骇。 因此，生物信息學分析和解釋必須考慮到這一點读拆。 如果需要擅憔，可以使用替代方法如氧化亞硫酸氫鹽測序（OxBS-seq）[12]或Tet輔助亞硫酸氫鹽測序（TAB-seq）[13]來檢測5hmC。

5hmc：羥甲基化（5-羥甲基胞嘧啶（5hmC））
5mC：

# 背景
亞硫酸氫鹽測序方法不能區(qū)分5mC和5hmC檐晕，因為用任一標記修飾的胞嘧啶都不受亞硫酸氫鹽的影響暑诸。

# 檢測5hmc方法：
氧化亞硫酸氫鹽測序（OxBS-seq）或Tet輔助亞硫酸氫鹽測序（TAB-seq）

2 Materials

2.1 Reagents

1. PureLink Genomic DNA Mini Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).
2. Quant-iT dsDNA Assay Kit, high sensitive (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).
3. Snap-Cap MicroTUBE vials (Covaris, Woburn, MA, USA).
4. 4–20% Criterion? TBE Gel (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).
5. Low-binding DNAse-/RNAse-free microtubes (Ambion, Waltham, MA, USA).
6. TBE buffer, 10×, Molecular Biology Grade (Promega, Madison, WI, USA).
7. Sybr Gold (Invitrogen, Waltham, MA, USA).
8. TruSeq Nano DNA Sample Prep Kit (Illumina, San Diego, CA, USA).
9. EpiTect Bisulfite Kit (Qiagen, Hilden, Germany).
10. AMPure XP beads (Beckman Coulter, Brea, CA, USA).
11. PfuTurbo Cx hotstart DNA polymerase (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA).
12. 100 mM dNTP mix (25 mM of each dNTP; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA).
13. EvaGreen (Biotium, Fremont, CA, USA).
14. 100% ethanol.
15. 10× PBS (GenDepot, Katy, TX, USA).
16. Ultrapure DNAse-/RNAse-free water (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA)
17. 100 bp DNA Ladder (GenDepot, Katy, TX, USA).
18. 6× DNA loading dye (Promega, Madison, WI, USA).
19. High Sensitivity DNA Kit (Agilent, Santa Clara, CA, USA).

2.2 Equipment

1. Covaris S2 system (Covaris, Woburn, MA, USA).
2. MicroTube holder (Covaris, Woburn, MA, USA).
3. Dark Reader transilluminator (Clare Chemical Research, Dolores, CO, USA).
4. Qubitfluorometer (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).
5. DynaMag-2 magnet (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).
6. Bio-Rad Thermal cycler (Bio-Rad, CFX96 Touch, Hercules, CA, USA).
7. Real-time PCR cycler (Bio-Rad, C1000, Hercules, CA, USA).
8. Criterion cell system (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).
9. Heat blocks.
10. Vortex mixer.
11. Bioanalyzer (Santa Clara, CA, USA).
12. Illumina HiSeq 2500 (San Diego, CA, USA).

3方法

3.1基因組DNA分離

3.2 DNA片段化和清除片段化DNA

3.3末端修復，Poly-a尾和接頭連接（Illumina Nano DNA樣品制備試劑盒）

1. 在最高60μL體積中使用100 ng-1μg片段化DNA棉姐。添加重懸浮緩沖液使總體積達到60μL屠列。

2. 加入40μL末端修復混合物，總體積為100μL伞矩，通過移液整個體積10次混勻笛洛，并全速離心30秒。

3. 在30°C孵育30分鐘乃坤，然后將樣品置于冰上（見注6）苛让。

4. 從試劑盒中渦旋樣品純化珠粒以確保均勻分布。使用前將珠子溫熱至室溫湿诊。

5. 在65μL無核酸酶水中稀釋95μL樣品純化珠狱杰。

6. 將160μL稀釋的樣品純化珠加入末端修復反應混合物中。移取整個體積十次并在室溫下孵育5分鐘厅须。

7. 將管放在磁力架上5分鐘仿畸。

8. 將250μL含有目標DNA的上清液從每個管中轉(zhuǎn)移到新的PCR管中。丟棄含有珠子的管子。

9. 渦旋樣品純化珠至少1分鐘错沽。將30μL室溫未稀釋的樣品純化珠加入含有250μL上清液的每個樣品中簿晓。移取整個體積十次。

10. 在室溫下孵育5分鐘千埃。

11. 將樣品置于室溫下的磁架上5分鐘或直至液體澄清憔儿。

12. 小心地從管中取出并丟棄所有上清液，不要打擾珠子放可。

13. 在磁架上放置管子谒臼，用200μL新制的80％EtOH沖洗兩次。

14. 將磁珠顆粒在磁力架上風干5分鐘耀里。

15. 用20μL重懸浮緩沖液重懸珠子蜈缤，并通過移液整個體積十次充分混合。在室溫下孵育2分鐘备韧。

16. 將管放在磁架上5分鐘劫樟。

17. 將17.5μL澄清的上清液轉(zhuǎn)移到新的PCR管中。

18. 將12.5μLA尾加入混合物加入到17.5μL上清液中织堂，并將整個體積的反應混合物移液十次。

19. 在37°C孵育30分鐘奶陈，在70°C孵育5分鐘易阳，并保持在4°C（見注7）。

20. 當熱循環(huán)儀溫度在4°C下保持5分鐘時吃粒，從中取出管子潦俺。短暫離心并保持在冰上然后進行下一個連接步驟。

21. 向反應混合物中加入2.5μL重懸浮緩沖液徐勃，2.5μL連接混合物和2.5μLDNA銜接子指數(shù)事示。

22. 移取整個體積十次并短暫離心。

23. 在30°C孵育10分鐘僻肖，然后置于冰上肖爵。

24. 向混合物中加入5μL終止連接緩沖液并用移液管混合。

25. 加入42.5μL充分混合的樣品純化珠臀脏，移液10次劝堪，在室溫下孵育5分鐘。

26. 將管放在磁架上5分鐘揉稚。

27. 小心取出并丟棄80μL上清液秒啦，不要打擾珠子。

28. 用200μL新鮮制備的80％乙醇洗滌珠子兩次搀玖。在室溫下風干5分鐘余境。

29. 從磁架上取下管子，通過移液十次將珠子重新懸浮在52.5μL的重懸浮緩沖液中。在室溫下孵育2分鐘芳来。

30. 在室溫下將管放在磁架上5分鐘暴氏。

31. 將50μL上清液轉(zhuǎn)移到新的PCR管中。

32. 加入50μL充分混合的樣品純化珠绣张，移液10次答渔，在室溫下孵育5分鐘。

33. 小心取出并丟棄100μL上清液侥涵，不要打擾珠子沼撕。

34. 用200μL新鮮制備的80％乙醇洗滌珠子兩次。在室溫下風干5分鐘芜飘。

35. 從磁架上取下管子务豺，通過移液十次將珠子重新懸浮在27.5μL重懸浮緩沖液中。在室溫下孵育2分鐘嗦明。

36. 在室溫下將管放在磁架上5分鐘笼沥。

37. 將25μL上清液轉(zhuǎn)移到新的PCR管中。

38. 繼續(xù)進行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化娶牌。

3.4亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化

1. 根據(jù)制造商的建議（EpiTect Bisulfite Kit奔浅，Qiagen）設置亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化率。
   亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化反應混合物：
2. 根據(jù)制造商的建議進行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化诗良，以避免模板降解和處理和凈化過程中的DNA損失汹桦，同時實現(xiàn)DNA的高亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化率。 連續(xù)兩輪亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化有助于達到≥99％的轉(zhuǎn)化率鉴裹。
3. PCR conditions.
4. ......

3.5 3.5文庫PCR擴增和珠子純化

Library PCR Amplification and Bead Purification

1. 準備PCRmix
2. 在實時PCR循環(huán)中擴增反應舞骆。
3. 為了最小化PCR引起的偏差，監(jiān)測擴增循環(huán)径荔。 最佳PCR循環(huán)是擴增曲線的線性相的中點督禽。 紅線標記擴增曲線的線性相位的中點，并用于確定最佳擴增循環(huán)數(shù)（圖3a总处，見注11）狈惫。

334970_1_En_9_Fig3_HTML.gif

圖3：WGBS庫QC。 （a）用熒光染料EvaGreen進行最終PCR擴增的實時分析實例辨泳。 使用CFX96 Touch實時PCR檢測系統(tǒng)（Bio-Rad）獲得結(jié)果虱岂。 （b）在生物分析儀（安捷倫）上分析的最終文庫的大小分布示例

4. PCR完成后，將每個反應組合并使用1×AMPure XP珠純化PCR產(chǎn)物菠红。

5. 洗去20μL重懸浮緩沖液第岖。

3.6 Library Quality Control

1. 使用Qubit熒光計量化文庫。 預期的DNA濃度為10-30 ng /μL试溯。
2. 使用Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit運行1μL最終文庫蔑滓，檢查文庫大小分布。 預期的平均分布大小為300-500 bp（圖3b）。

4 注意

11.與其他方法相比键袱，WGBS方法準確且可重復燎窘。偏差和測量誤差的主要來源于不完全的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化和序列的甲基化與非甲基化形式的差異PCR效率。

等等