20世紀(jì)60年代后期流式細胞術(shù)開始得到廣泛應(yīng)用于购，通過流式細胞儀可以快速的定量分析細胞群的物理化學(xué)特征室谚，同時可以根據(jù)這些物理化學(xué)特征對銑刀進行精確分選。今天就來簡單的介紹一下流式細胞術(shù)犀概。
流式細胞儀
首先我們簡單的了解一下流式細胞儀脾拆，市面上的流式細胞儀型號有許多種，但其基本結(jié)構(gòu)都是相同的岖食，分析性流式細胞儀幾乎都是由液流系統(tǒng)红碑、光路系統(tǒng)、檢測分析系統(tǒng)組成泡垃。
1.液流系統(tǒng)?
2.光路系統(tǒng)
光路系統(tǒng)始于激光器析珊，其分類方法繁多，最常見的分類方法是根據(jù)其發(fā)射的激光的波長來分蔑穴，常見的有藍激光器488nm忠寻、紅激光器635nm和紫激光器405nm，不同的激光器發(fā)出的激光照射到細胞后產(chǎn)生的光信號會經(jīng)過不同的光路系統(tǒng)被不同的通道接收存和。
流式細胞儀采集的光信號包括散射光信號和熒光信號奕剃，散射光信號也就是我們常說的FSC（前向散射光衷旅，反應(yīng)細胞的大小）纵朋、SSC（側(cè)向散射光柿顶，反應(yīng)細胞的復(fù)雜程度）；熒光信號是細胞上結(jié)合有熒光素操软，被激光激發(fā)以后嘁锯，會發(fā)射熒光信號。
3.檢測分析系統(tǒng)
檢測分析系統(tǒng)就是以通道為單位將細胞的各個通道的光信號匯總分析聂薪，最后得出樣品群體中細胞的物理化學(xué)特征家乘。其中通道（光電倍增管）有2個作用：
①將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娮有盘枺?/p>
②放大電子信號〔匕模可以分為散射光通道（FSC通道仁锯、SSC通道）和熒光通道，一個激光器下可以有多個熒光通道笆载，一個通道對應(yīng)多個熒光染料扑馁。
樣品細胞檢測流程
流式細胞術(shù)檢測的對象一般是呈獨立狀態(tài)的懸浮于液體中的細胞，如果要檢測組織中的細胞凉驻，則必須先將組織制備成單細胞懸液，而后方可進行檢測复罐。
制備基本流程如下：
1.細胞的培養(yǎng)涝登、制備
將一定數(shù)量的單個細胞收集于1.5mL的EP管中，2400rpm效诅、4℃離心4min胀滚，棄上清缝龄；加入1xPBS清洗抵拘，同等條件進行離心垮庐，棄上清何鸡。
2.封閉
用來標(biāo)記樣品細胞的熒光素偶聯(lián)抗體多為單克隆抗體驮捍，少數(shù)也可能是多克隆抗體猜旬，但其基本結(jié)構(gòu)都是由兩部分組成：包含有特異性結(jié)合抗原位點的Fab段沉眶、相對保守的Fc段球匕∷簦抗體的特異性表現(xiàn)在Fab段施掏，標(biāo)記時利用Fab段的抗原結(jié)合位點與細胞上抗原分子進行特異性結(jié)合，從而進行標(biāo)記并且相對量化的展示了細胞表達該抗原分子的情況茅糜。
3.熒光素偶聯(lián)抗體標(biāo)記
以CD3-APC-Cy7七芭、CD4-FITC為例，一般染色體系推薦100μl蔑赘，CD3狸驳、CD4表達量相對較高预明，1μl足夠了，假如有9個樣本耙箍，分別取10μlCD3-APC-cy7贮庞、CD4-FITC加到含有990μl的1.5ml的EP管中，混勻后究西，分別取100μl加到9個樣品孔中窗慎，混勻，室溫卤材、避光染色20min遮斥。時間到后加1ml FACS buffer洗去未結(jié)合的抗體，2400rpm扇丛、4°C離心4min术吗，棄上清，加200μl FACS buffer或2%的多聚甲醛重懸沉淀帆精，并盡快上機分析较屿。
4.光電倍增管電壓的設(shè)定
上機分析時，在確認(rèn)機器沒有問題后卓练，需調(diào)節(jié)每個通道的光電倍增管的電壓隘蝎，從而區(qū)分細胞群，利用FSC和SSC襟企，通過調(diào)節(jié)FSC和SSC的電壓嘱么，區(qū)分淋巴細胞亞群，使樣品細胞或者目標(biāo)細胞位于流式圖的中央或者靠近中央的位置顽悼。FSC和SSC的電壓確定之后還需調(diào)節(jié)APC-cy7曼振、FITC的電壓，使陽性細胞群和陰性細胞群盡可能的分離蔚龙。
5.設(shè)置對照冰评，補償調(diào)節(jié)
流式實驗中對照設(shè)置很重要，常見的有陰性對照木羹、FMO對照甲雅、補償單陽管對照。
實驗注意事項
1.?因?qū)嶒炐璞ＷC待檢測樣品細胞為單細胞懸液汇跨，因此在細胞培養(yǎng)务荆、制備階段，貼壁細胞需用先用胰酶消化成單個細胞穷遂，而后再后收集待測樣品細胞函匕；胸腺、脾臟和淋巴結(jié)等外周免疫器官蚪黑，主要由免疫細胞組成盅惜，只需直接將臟器經(jīng)鋼網(wǎng)研磨即可制成單細胞懸液中剩；實體臟器肺臟、肝臟和腫瘤組織內(nèi)含有較多的結(jié)締組織抒寂，而實體臟器細胞之間一般結(jié)合緊密结啼，所以直接簡單的將臟器進行研磨是無法得到理想的單細胞懸液的，因此屈芜，研磨前需將臟器剪碎后加入IV型膠原酶和DNA核酸內(nèi)切酶消化郊愧，而后再將消化后的組織用研磨棒直接研磨，從而得到理想的單細胞懸液（實體臟器研磨后的單細胞懸液以實體細胞為主井佑，如果研究目標(biāo)不是實體細胞属铁，而是臟器內(nèi)浸潤的免疫細胞，可以用Percoll密度梯度離心法富集免疫細胞）躬翁。而后對收集到的理想的單細胞懸液進行離心焦蘑、洗滌、封閉盒发、標(biāo)記熒光素偶聯(lián)抗體后例嘱，即可進行流式分析。
2.?調(diào)節(jié)電壓時宁舰，如果檢測的目標(biāo)細胞體積較小拼卵，可以適當(dāng)提高電壓值，使目標(biāo)細胞與細胞碎片在流式圖中能夠完全分離明吩；如果檢測的目標(biāo)細胞體積較大间学，可以適當(dāng)降低電壓值，使所有的目標(biāo)細胞群完整顯示于流式圖中印荔，防止細胞群接近于流式圖的邊界而變形扭曲或者完全處于邊界外。
3.?關(guān)于樣本的封閉详羡，并不是標(biāo)記熒光素偶聯(lián)抗體之前必須封閉樣品仍律，一般樣品細胞與流式抗體的種屬來源是不同的，如標(biāo)記人的細胞的熒光素偶聯(lián)抗體一般來源于小鼠实柠，人細胞的FcR也不一定能夠與小鼠來源的熒光素偶聯(lián)抗體的Fc段結(jié)合水泉，但是，也有可能因為種屬關(guān)系較近窒盐，或者在一定環(huán)境條件下這種不同種屬間的Fc段和FcR也能結(jié)合草则，實驗者很難判斷實驗過程中這種結(jié)合是否會發(fā)生，但是在標(biāo)記熒光素偶聯(lián)抗體前封閉樣品卻可以保證這種非特異性結(jié)合一定不會發(fā)生蟹漓。所以炕横，當(dāng)條件允許時，實驗者最好選擇對實驗樣品進行封閉處理葡粒。
