親和力概念

“有結合才會有有功能薄嫡，有功能一定有結合封断∠菩颍”Binding(結合)和Function（功能）是體外藥效初步評價中最重要的兩環(huán)，對于候選藥物來說救氯，結合是其藥物發(fā)揮功能的必要條件找田，但并非充分的條件。評價一個候選藥物着憨，其與靶點分子的結合能力是最基礎也是最重要的一方面墩衙。藥物和靶點分子的結合可分為不可逆結合和可逆結合，上市藥物中甲抖，絕大數(shù)藥物和靶點分子的結合可逆結合漆改，這有利于藥物進入人體內后能夠更容易的代謝，減少可能存在的長期蓄積和安全性風險准谚。不論小分子藥物還是大分子藥物的研發(fā)過程中均會使用親和力(affinity)來評價候選分子和靶點分子之間結合的強弱挫剑，這里需要明確的是親和力(affinity)是可逆反應過程中候選分子，靶點分子表位和候選分子-靶點分子結合物之間的相對狀態(tài)的特征函數(shù)柱衔，其更加專業(yè)性和術語化的名稱是解離平衡常數(shù)KD樊破，單位mol/L(和濃度單位一致)。如果一個靶點提供多個結合位點唆铐，有時候也稱這種結合強弱為結合力（Avidity）哲戚。一般來講，候選分子和靶點分子的結合越強艾岂，即親和力越大顺少，其解離平衡常數(shù)越小。解離平衡常數(shù)的單位是濃度單位王浴，這個和在藥物研發(fā)過程中進行生物學功能評價常常會得到IC50,EC50等單位一致脆炎，也常常會使得這些專有名詞出現(xiàn)亂用，混用乃至相互比較的情況叼耙，從而得到錯誤的結論腕窥。如果我們需要比較透徹的理解親和力的概念粒没，首先得從可逆反應講起筛婉。

可逆反應

在生物體內，可逆反應是最常見也是最重要的化學反應過程，配體和受體的反應爽撒，抗體和抗原的反應入蛆，酶和底物反應都是可逆反應的過程∷段穑可逆反應過程中以抗原和抗體的反應為例哨毁，既有正相的反應過程，即抗原和抗體結合反應生成抗原-抗體復合物的正反應過程源武，也有逆向反應扼褪，抗原-抗體復合物解離反應生成抗原，抗體的逆反應過程粱栖，當一個可逆反應中正反應和逆反應的速度相等時话浇，反應體系中抗原的濃度，抗體的濃度和抗原-抗體復合物濃度不再增加也不再減少闹究，可逆反應完成幔崖，反應體系中各成分濃度處于動態(tài)平衡。針對同一抗原渣淤，不同的抗體A赏寇，B，相同分子濃度的抗體A价认，B和同一分子濃度的抗原反應嗅定，如果A抗體相對于抗原的親和力要強于B抗體，那么可逆反應完成各物質形成動態(tài)平衡后用踩，A抗體-抗原復合物的濃度要比B抗體-抗原復合物濃度高露戒，也可以說抗原提供的結合位點中，A占據(jù)的位點要比B占據(jù)的位點要多捶箱。這只是對于可逆反應和親和力簡單的描述智什，怎么將親和力進行量化進行比較，在無機化學丁屎，生物學和藥物研發(fā)過程中對于親和力的檢測已經有了很多測量方法荠锭。

親和力檢測的化學原理

? 基礎研究對于可逆反應的過程，以及其化學動力學晨川，熱力學原理已經有比較清晰的研究证九，假設R（受體）和L（配體）是單價反應，如下圖所示共虑，可以用下面幾個數(shù)學公式進行概括1：

Kon（Ka）:結合速率常數(shù)愧怜，用于評估R（受體）和L（配體）結合形成RL（受體配體復合物）速率快慢的常數(shù)，R和L正反應速度V=[R]f * [L]f *Kon（動力學參數(shù)）

Koff（Kd）: 解離速率常數(shù)妈拌，用于評估RL（受體配體復合物）逆向解離形成R（受體）和L（配體）速率快慢的常數(shù)拥坛， RL解離形成R和L的逆反應速度V=[R]f * [L]f * Koff蓬蝶。（動力學參數(shù)）

KA :結合平衡常數(shù)：用于評估可逆反應強弱的常數(shù)參數(shù)，進入平衡狀態(tài)時猜惋，反應體系中自由的R（受體）丸氛，自由的L（配體）和RL（受體配體復合物）三者之間相關關系的常數(shù)。該常數(shù)越大著摔，說明R（受體）和L（配體）的親和力越強缓窜。

KD:解離平衡常數(shù)：用于評估可逆反應強弱的常數(shù)參數(shù)，進入平衡狀態(tài)時谍咆，反應體系中自由的R（受體）禾锤，自由的L（配體）和RL（受體配體復合物）三者之間相關關系的常數(shù)。結合平衡常數(shù)的倒數(shù)摹察，該常數(shù)越小时肿，說明R（受體）和L（配體）的親和力越強，單位為mol/L,和因為濃度單位相同便于比較和書寫港粱，一般用于表示親和力的大小螃成，該常數(shù)越小，說明R（受體）和L（配體）的親和力越強查坪。

三個公式分別代表了三種進行親和力檢測的方法寸宏，熱力學檢測方法（公式一）；動力學檢測方法（公式二）和平衡動力學檢測方法（公式三）偿曙，那么三種檢測方法具體的實驗方法又有哪些呢氮凝？

熱力學檢測方法

等溫滴定量熱法（ITC）是用于量化研究各種生物分子相互作用的一種技術。它可直接測量生物分子結合過程中釋放或吸收的熱量望忆。ITC是能夠在一次試驗中同時確定多種結合參數(shù)的技術罩阵。ITC可以測定結合配偶體在自然狀態(tài)下的親和力，無需通過熒光標記或固定化技術對結合配偶體進行修飾启摄。通過測量結合過程中的熱傳遞稿壁，就能夠準確地確定結合常數(shù)（KD）、反應化學量（n）歉备、焓（H）和熵（ΔS）等傅是。如下圖所示2，

動力學檢測方法

采用表面等離子共振技術蕾羊，英文簡寫SPR喧笔，是從20世紀90年代發(fā)展起來的一種新技術，其應用SPR原理檢測生物傳感芯片（biosensor chip）上配體與分析物之間的相互作用情況龟再，該方法能夠測量配體與分析物的動力學參數(shù)Kon:結合速率常數(shù)和Koff: 解離速率常數(shù)书闸。如下圖所示，某抗體及其突變體相對于某抗原在不同pH進行結合和解離的動力學檢測結果3利凑。動力學檢測的圖形浆劲。曲線先呈上升趨勢嫌术，這個是結合曲線；然后為下降趨勢梳侨，為解離曲線蛉威。結合曲線的斜率反應了抗體和抗原的反應速度日丹，在相同的上樣濃度下走哺，也說明結合速率常數(shù)越大；解離曲線的斜率反應了抗體和抗原的反應生成抗體-抗原復合物的速度哲虾，在相同的上樣濃度下丙躏，斜率越抖也說明結合速率常數(shù)越大；解離曲線的斜率反應了抗體-抗原復合物解離形成抗體和抗原的速度束凑，在相同的抗體-抗原復合物濃度下晒旅，斜率越平緩說明解離速率常數(shù)越小，根據(jù)公式結合速率常數(shù)越大汪诉，解離速率常數(shù)越小废恋，抗體相對于抗原的親和力越強。類似的技術還有生物膜干涉技術測定方法（BLI）

動態(tài)平衡測定法（飽和濃度法）

如公式三所示扒寄，如果我們需要測量KD鱼鼓，我們需要測量動態(tài)平衡以后溶液中游離的R的濃度，游離的L的濃度和R-L復合物的濃度该编。這無疑是一個復雜的檢測過程迄本，在實際的應用過程中經過公式推導和假設以后轉變成以下公式，如下圖所示即少量R存在的情況下课竣，將L進行梯度稀釋嘉赎，檢測R-L復合物的濃度，當R-L復合物的濃度占總R濃度的一半時于樟，L對應的濃度值（EC50）即L相對于R的KD值公条。只有在此在特定的實驗條件下EC50值能夠等價于KD值。動態(tài)平衡測定法測定KD值有幾個關鍵點迂曲，即相互作用的兩個分子赃份，R要少量，L要進行連續(xù)的梯度稀釋奢米，得到平臺期最大的信號響應值（所有的R的結合位點被L占據(jù)）抓韩，那么在此條件下，占據(jù)一半R時鬓长，所需要的L濃度（EC50）為KD值谒拴。利用此方法進行KD測量的方式多樣，往往會對L進行標記涉波，等R-L形成動態(tài)平衡后英上，利用物理手段去除未反應的L后測得的標記的L的信號值能夠完全代表R-L復合物炭序。具體的實驗方法有同位素標記測定，偏振熒光測定苍日，流式細胞術進行測定惭聂，ELISA進行測定等多種方法。這樣的測量對于R的濃度和純度沒有要求相恃，只要相對少量辜纲，如流式測量方法的R往往是細胞攜帶的，Cell-BasedELISA方法中受體的提供者也是細胞拦耐，但是對于L是需要比較純度和精確濃度耕腾，因其濃度是直接和KD對應的。

三類檢測親和力方法比較

可逆反應中兩個物質的親和力受到溫度和反應體系中溶液環(huán)境（鹽離子強度杀糯，PH值）等影響扫俺，不同測定方法在相同反應條件下理論上是一致的。如下圖文獻記載的流式測定方法和SPR動力學測定方法4固翰，ELISA測定方法和同位素標記測定方法5或者ELISA測定方法和生物膜干涉技術測定方法（動力學檢測）進行親和力測定結果的比較狼纬。

三類檢測方法中，熱力學檢測方法在藥物研發(fā)過程用的相對較少骂际，動力學檢測方法更偏向于儀器分析方法疗琉，有很高靈敏度，親和力測定范圍和穩(wěn)定性方援，能夠得到動力學參數(shù)没炒，Kon

koff但是儀器成本和維護成本較高，通量較少犯戏，適合做最終的功能學評價和質量表征送火。動態(tài)平衡測定法（飽和濃度法）是最為通用的檢測方法，其形式也多樣先匪，適合從初期的高通量篩選种吸，中期的親和力評價到最終的產品放行，但檢測往往是間接的呀非，需要對檢測方法進行多方面驗證坚俗。不同化學原理親和力檢測方法和檢測形式之間的相互關聯(lián)對照有利于對親和力檢測方法的準確性進行評價和驗證。

親和力測定方法之競爭法

在動態(tài)平衡測定法（飽和濃度法）往往會用到競爭法對待測樣品的親和力進行評價岸裙。競爭法的基本過程是選擇少量的靶點分子和能夠占據(jù)該靶點分子80%結合位點的標記的信號分子濃度猖败，加入梯度稀釋的待測樣品，將三者進行混合反應后檢測靶點分子-信號分子復合物的信號值降允，繪制待測樣品濃度和信號的劑量曲線恩闻，該曲線往往是反S型，得到IC50值剧董，IC50越小幢尚，說明該待測樣品和靶點分子的親和力越強破停。值得說明的是采用競爭法進行親和力的檢測，其得到的IC50和KD值之間具有相關性尉剩，但是并不是等價的真慢。KD值和IC50相關，同時也跟標記分子的加入濃度和標記分子相對于靶點分子的KD值有關理茎，所以得到的IC50值和其他親和力測定方法測到的KD值不具有可比性黑界。如下圖所示采用ELISA技術采用直接法和競爭法得到的EC50（C值）和IC50值（C值），EC50值可認為等價于KD值功蜓，而IC50值卻不能等價于KD值园爷，EC50值和IC50值相差10倍以上宠蚂。需要明確的是只有當劑量曲線描述的是分子間相互作用關系即抗原和抗體的反應時式撼，EC50值才能夠等價于KD值（如細胞表面的受體和抗體的結合），如果抗原和抗體相互作用后發(fā)揮的其他的功能效用得到的EC50（配體引起細胞的增殖求厕，信號代表細胞的數(shù)目）著隆，其和KD值之間有相關性，但不能夠等同呀癣。

在有對照品的情況下美浦，采用競爭法可進行親和力相對強弱的比較，無需標記待測樣品项栏，這個在高通量篩選過程中顯得比較重要浦辨，能夠節(jié)省大量純化樣品，標記樣品的時間和耗費沼沈，而且能夠避免標記對待測樣品可能存在對親和力的影響流酬，在初期篩選過程中是比較常用的檢測方式。需要說明的是采用競爭法是待測樣品和標記分子競爭同一靶點分子上相同的結合位點列另，這樣進行篩選能夠篩選出針對特定靶點分子結合位點的陽性樣品芽腾，如果待測樣品能夠和靶點分子結合但不是該特定的位點，檢測結果的陰性页衙，這種情況下為假陰性情況摊滔。

展望

親和力是評價可逆反應過程中兩個分子間相互作用強弱的特征參數(shù)。根據(jù)其化學原理有熱力學測定方法店乐，動力學測定方法和平衡濃度測定法艰躺，三種方法在相同的反應條件下測得的親和力值即解離平衡常數(shù)KD值是可比的。但是需要根據(jù)具體的實驗方案謹慎評估和區(qū)分的親和力KD值和實驗結果EC50眨八，IC50之間的關系腺兴。

親和力是藥物是否藥效的關鍵功能屬性之一，但也不是說越強的親和力就能發(fā)揮越強效果踪古，很多時候需要根據(jù)藥物作用的機理來選擇合適親和力乃至合適親和力相關的動力學參數(shù)Kon,Koff含长。準確的評價候選藥物親和力是了解候選藥物作用機理的第一步券腔，如在抗體藥物進行實體瘤治療的過程中，太強的親和力抗體可能會導致大分子抗體只能在實體瘤血管附近聚集拘泞，從而影響抗體在實體瘤部位的擴散和蓄積纷纫，導致藥效的較少，這個時候親和力較弱10-8nM的抗體要比10-10nM抗體可能會有更好的療效陪腌，更大Koff參數(shù)會有更好的效果6辱魁。又如將抗體的CDR區(qū)部分氨基酸突變成組氨酸后，突變抗體可以獲得在酸性PH值比中性PH值更弱的親和力诗鸭，這個可能有利于抗體在細胞內部核內體和溶酶體酸性條件的解離和擴散,有利于抗體結合的內化受體重新回到細胞表面染簇，繼續(xù)激活受體介導的細胞活性7等。

平衡濃度測定法用來進行待測樣品的高通量親和力篩選最為通用的實驗方法强岸，而待測樣品往往是混合樣品锻弓，如在96微孔板中用ELISA方法進行小鼠免疫血清滴度測定，雜交瘤培養(yǎng)上清中的抗體親和力測定蝌箍，噬菌體展示淘選篩選過程陽性噬菌體克隆的選擇等青灼。這樣的樣品往往成分比較復雜干擾性強，待測樣品中有效成分較少濃度不確定妓盲，進行的是單點測定杂拨。如何建立起信號強度值和待測樣品相對于靶點分子親和力之間的直接可信的相關聯(lián)系，排除雜質成分和有效成分濃度不均一造成的影響悯衬，這個是簡單的了解親和力的化學原理和理想條件下親和力評價實驗方案無法解決的問題弹沽，需要更加深入的理論推導，實驗經驗和實驗條件綜合判斷筋粗。