The systemic response to surgery triggers the outgrowth of distant immune-controlled tumors in mouse models of dormancy刘急，if=16.761械荷，Sci Transl Med.?2018 Apr 11;10(436). pii: eaan3464. doi: 10.1126/scitranslmed.aan3464

背景

臨床現(xiàn)象：乳腺癌原發(fā)灶切除術(shù)后站玄，一大部分患者會(huì)在術(shù)后12-18個(gè)月出現(xiàn)遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)掖举，一般術(shù)后1-1.5年復(fù)發(fā)朗徊，稱為同時(shí)性復(fù)發(fā)synchronous 首妖。結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移有同時(shí)性肝轉(zhuǎn)移和異時(shí)性肝轉(zhuǎn)移的定義，《結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移診斷和綜合治療指南v2013》中爷恳，將直腸癌術(shù)后6個(gè)月內(nèi)的發(fā)生的轉(zhuǎn)移稱為同時(shí)性肝轉(zhuǎn)移有缆，6個(gè)月異常定義為異時(shí)性肝轉(zhuǎn)移。等到v2016版時(shí)温亲，同時(shí)性肝轉(zhuǎn)移(synchronous liver metastases)是指結(jié)直腸癌確診前或確診時(shí)發(fā)現(xiàn)的肝轉(zhuǎn)移棚壁；而結(jié)直腸癌根治術(shù)后發(fā)生的肝轉(zhuǎn)移稱為異時(shí)性肝轉(zhuǎn)移(metachronous liver metastases，又可分為"早期異時(shí)性肝轉(zhuǎn)移"和"晚期異時(shí)性肝轉(zhuǎn)移"铸豁。

關(guān)于乳腺癌術(shù)后1-1.5年復(fù)發(fā)的推測(cè)灌曙，有人說(shuō)這是疾病的自然進(jìn)展，也有人認(rèn)為是手術(shù)刺激了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)节芥。乳腺癌是全身性疾病在刺，在發(fā)病診斷時(shí)逆害，已經(jīng)有腫瘤細(xì)胞在遠(yuǎn)處種植了，有些患者腫瘤細(xì)胞長(zhǎng)期處于靜止?fàn)顟B(tài)蚣驼，另外一些患者腫瘤細(xì)胞再次增生生長(zhǎng)魄幕，具體是那些因素刺激了靜止?fàn)顟B(tài)細(xì)胞的在生長(zhǎng)？

題目里有三個(gè)關(guān)鍵詞：手術(shù)引發(fā)的炎癥反應(yīng)颖杏、免疫控制的腫瘤細(xì)胞纯陨、腫瘤潛伏期的大鼠模型。手術(shù)后的炎癥反應(yīng)如何量化留储，有哪些biomarker翼抠？如何鑒定遠(yuǎn)處定植的腫瘤細(xì)胞，而且還是被免疫控制的呢获讳？乳腺癌潛伏期的大鼠模型如何制備阴颖，模型怎么評(píng)價(jià)成功？驗(yàn)證炎癥使遠(yuǎn)處腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的原因的邏輯如何安排丐膝？

動(dòng)物模型的制備

Balb/c小鼠是最常見(jiàn)的乳腺癌動(dòng)物模型量愧，將D2A1乳腺癌細(xì)胞種植于Balb/c小鼠皮下，會(huì)形成乳腺癌移植瘤模型帅矗。GFP綠色熒光蛋白是有效刺激T細(xì)胞的抗原偎肃，通過(guò)基因工程制作能表達(dá)GFP的D2A1乳腺癌細(xì)胞，再皮下注射浑此，產(chǎn)生的腫瘤細(xì)胞含有GFP會(huì)激活T細(xì)胞的免疫功能累颂，腫瘤生長(zhǎng)反而受到抑制。在免疫功能受損的NOD/SCID小鼠尤勋，種植D2A1-GFP瘤細(xì)胞喘落，腫瘤生長(zhǎng)并不受影響。NOD/SCID=nonobese diabetic/severe combined immunodeficient非糖尿病免疫功能嚴(yán)重缺陷小鼠最冰。

為什么D2A1-GFP瘤細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制瘦棋，是針對(duì)GFP的T細(xì)胞的免疫殺傷在起作用嗎？收集移植瘤模型中引流腫瘤淋巴液中的白細(xì)胞leukocytes暖哨，體外ex vivo將其與D2A1-GFP瘤細(xì)胞共培養(yǎng)赌朋，可以檢測(cè)到白細(xì)胞釋放大量IFN-γ，提示激活細(xì)胞免疫篇裁。IFN-γ是細(xì)胞免疫激活的標(biāo)志物沛慢。這種細(xì)胞免疫需要CD8+細(xì)胞和GFP抗原結(jié)合起作用。中和抗體刪除小鼠體內(nèi)CD8+达布，腫瘤生長(zhǎng)不受限制团甲；GFP免疫耐受小鼠體內(nèi)，CD8+不會(huì)識(shí)別GFP黍聂，移植瘤生長(zhǎng)同樣不受限制躺苦。（需要制備GFP轉(zhuǎn)基因小鼠身腻，在生殖細(xì)胞內(nèi)即表達(dá)GFP，之后動(dòng)物對(duì)GFP形成免疫耐受）匹厘。

上述方法制造的D2A1-GFP移植瘤模型嘀趟，腫瘤長(zhǎng)到一定程度會(huì)停滯，持續(xù)2-3周后發(fā)生排斥反應(yīng)致腫瘤縮小愈诚。在停滯期考慮腫瘤生長(zhǎng)和機(jī)體細(xì)胞免疫達(dá)到平衡狀態(tài)她按，而這種平衡狀態(tài)很容易被破壞，比如手術(shù)刺激炕柔。

手術(shù)應(yīng)激如何實(shí)施及評(píng)價(jià)（沒(méi)有評(píng)價(jià)）

重點(diǎn)放在切口愈合酌泰，教科書描述經(jīng)典切口愈合：中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞首先聚集，之后纖維母細(xì)胞修復(fù)和血管形成匕累。切開(kāi)動(dòng)物模型皮下宫莱，植入無(wú)菌聚乙酸乙烯海綿，即可產(chǎn)生經(jīng)典傷口愈合模型哩罪，而且這種傷口愈合方法可以產(chǎn)生比較一致的biological response。如果是采取切除原發(fā)腫瘤的方法巡验，創(chuàng)面和出血等刺激在每個(gè)動(dòng)物模型都不完全相同际插。

分別取海綿植入7天和14天的細(xì)胞組織，觀察早期的中性細(xì)胞和巨噬細(xì)胞和晚期的纖維血管显设。

之前的疑問(wèn)：局部的炎癥環(huán)境是否不利于腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)框弛？答案是：局部的炎癥環(huán)境，破壞了機(jī)體的免疫功能捕捂，免疫功能不能有效控制腫瘤細(xì)胞瑟枫，反而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。不是不利于腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)指攒，而是不利于免疫細(xì)胞發(fā)揮功能了慷妙。將免疫原性腫瘤細(xì)胞D2A1-GFP注射至切口海綿處，腫瘤生長(zhǎng)明顯增大允悦，而沒(méi)有切口或注射至切口遠(yuǎn)處膝擂，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)相對(duì)較緩慢。

免疫原性瘤細(xì)胞注射至切口部位時(shí)隙弛，腫瘤生長(zhǎng)明顯加快架馋。

局部手術(shù)切口炎癥引發(fā)全身免疫反應(yīng)受損

將手術(shù)切口和免疫原性的腫瘤細(xì)胞注射于Balb/c小鼠不同部位，模擬機(jī)體遠(yuǎn)處的潛伏腫瘤細(xì)胞全闷，發(fā)現(xiàn)手術(shù)切口仍舊可以促進(jìn)遠(yuǎn)處瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)叉寂，該作用主要是通過(guò)手術(shù)炎癥抑制機(jī)體免疫功能發(fā)揮作用，因?yàn)樵趇mmunocompromised的NOD/SCID小鼠中总珠，手術(shù)切口炎癥并不能影響遠(yuǎn)處瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)情況屏鳍。該部分實(shí)驗(yàn)首先是模擬手術(shù)切口勘纯，然后再注射D2A1-GFP瘤細(xì)胞，觀察瘤細(xì)胞生長(zhǎng)情況孕蝉。

臨床實(shí)際上首先由乳腺癌細(xì)胞的遠(yuǎn)處播散屡律，然后再做手術(shù)，那么該次手術(shù)對(duì)術(shù)前那些播散的腫瘤細(xì)胞有沒(méi)有影響降淮〕瘢可以先在Balb/c小鼠體內(nèi)注射D2A1-GFP瘤細(xì)胞，體內(nèi)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和免疫控制達(dá)到平衡佳鳖，然后再模擬手術(shù)切口炎癥特咆，觀察瘤體生長(zhǎng)情況。結(jié)果同樣顯示腫瘤生長(zhǎng)增加贬芥。

最后改變手術(shù)切口炎癥造模方法靠益，只給予小鼠皮膚切開(kāi)縫合，炎癥反應(yīng)損傷更小穿挨。即使如此月弛，仍然可以影響遠(yuǎn)處已達(dá)到免疫平衡狀態(tài)的腫瘤細(xì)胞，使其生長(zhǎng)增加科盛。要證明手術(shù)引起的全身性炎癥會(huì)促進(jìn)遠(yuǎn)處腫瘤生長(zhǎng)帽衙，分別選用了切口植入海綿和單純切口等不同的炎癥模型方法，多方面論證贞绵。

切口炎癥和瘤體注射遠(yuǎn)離厉萝，仍然影響腫瘤生長(zhǎng)，模擬臨床先注射D2A1-GFP瘤細(xì)胞榨崩，然后在切口谴垫，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。

作者還選用了黑色素瘤細(xì)胞B16母蛛，制作B16-GVAX免疫原性腫瘤細(xì)胞翩剪，接種C57BL/6小鼠模型，同樣觀察到手術(shù)切口所引發(fā)的全身驗(yàn)證反應(yīng)彩郊，可以促進(jìn)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)肢专。

局部手術(shù)切口如何引發(fā)全身炎癥反應(yīng)，進(jìn)而影響瘤體

教課書上關(guān)于切口愈合過(guò)程描述：傷口局部中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞穿透血管壁轉(zhuǎn)移至傷口周圍焦辅，釋放趨化因子繼續(xù)引導(dǎo)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)移博杖，最終釋放大量炎癥因子。需要明確全身炎癥因子情況筷登。抽取模擬手術(shù)切口的小鼠血液剃根，檢測(cè)炎癥細(xì)胞和細(xì)胞因子，發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞和炎性單核細(xì)胞增多前方，IL-6狈醉、G-CSF和CCL2增多廉油，其中G-CSF和CCL2分別趨化中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞穿透血管壁。傷口引發(fā)的全身炎癥和局部炎癥基本相同苗傅。

哪一種腫瘤局部炎細(xì)胞tumor infiltrating cells（中性粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞）會(huì)影響腫瘤生長(zhǎng)抒线？分析移植瘤體內(nèi)白細(xì)胞數(shù)量情況，發(fā)現(xiàn)CD8+ T細(xì)胞數(shù)量與瘤體大小呈反比渣慕、與D2A1-GFP瘤細(xì)胞數(shù)量成反比嘶炭，而髓系來(lái)源的CD11b+與CD8+T呈反比，與D2A1-GFP呈正比逊桦，提示CD11b+可能對(duì)抗T細(xì)胞對(duì)腫瘤的殺傷作用眨猎。利用anti-Ly6G抗體可以刪除小鼠體內(nèi)的中性粒細(xì)胞，刪除中性粒細(xì)胞之后并不影響腫瘤生長(zhǎng)强经。而抑制單核巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)入移植瘤后睡陪，瘤體生長(zhǎng)受抑制，提示單核細(xì)胞是介導(dǎo)免疫抑制的元兇匿情。其實(shí)單核細(xì)胞轉(zhuǎn)入瘤體內(nèi)轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞兰迫，又稱為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞tumor-associated-macrophages，TAM在其他文獻(xiàn)報(bào)道中具有免疫抑制作用炬称。

全身血液中炎癥因子及細(xì)胞情況逮矛，在tumor infiltrating cells中CD11b+與瘤體呈正比，其中只有單核細(xì)胞會(huì)影響腫瘤生長(zhǎng)

那么腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞是否具有免疫抑制作用呢转砖？檢測(cè)D2A1-GFP移植瘤體內(nèi)的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其表面PD-L1表達(dá)升高鲸伴，升高的PD-L1可以和CD8+T細(xì)胞表面的PD受體結(jié)合府蔗，從而抑制CD8+T細(xì)胞的免疫殺傷作用。采用PD1抗體處理移植瘤小鼠汞窗，發(fā)現(xiàn)不管是切口炎癥小鼠還是未切口炎癥小鼠姓赤，CD8+殺傷作用增強(qiáng)，腫瘤明顯縮小仲吏。提示免疫原性移植瘤是immuno controlled的腫瘤不铆，其中PD-L1的低表達(dá)在其免疫控制中其重要作用。

控制手術(shù)切口引發(fā)的炎癥反應(yīng)裹唆，是否可以控制腫瘤的生長(zhǎng)

上述數(shù)據(jù)已經(jīng)提出相對(duì)完善的手術(shù)炎癥導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)的大體機(jī)制誓斥，如果上述推斷成立的話，給予美洛昔康抑制全身炎癥反應(yīng)许帐，將會(huì)減輕腫瘤的復(fù)發(fā)或動(dòng)物模型上的瘤體生長(zhǎng)劳坑。查閱相關(guān)文獻(xiàn)，確實(shí)有回顧性研究報(bào)道乳腺癌術(shù)后利用NSIADs類止痛藥的患者成畦，腫瘤復(fù)發(fā)率顯著降低距芬。只是文獻(xiàn)中沒(méi)有說(shuō)明：是NSIADs止痛藥直接具有腫瘤抑制作用涝开，還是通過(guò)其他抑制炎癥的機(jī)制抑制腫瘤。NSIADs究竟是通過(guò)哪種機(jī)制抑制腫瘤生長(zhǎng)框仔？作者所用的模型即可驗(yàn)證：D2A1-GFP移植瘤模型舀武，分為手術(shù)炎癥組和非手術(shù)組，給予美洛昔康抗炎后离斩，觀察哪組腫瘤生長(zhǎng)受到抑制银舱。手術(shù)組瘤體被抑制、非手術(shù)沒(méi)有被抑制捐腿，則為抗炎機(jī)制纵朋；手術(shù)組瘤體被抑制，非手術(shù)同樣被抑制茄袖，可能為直接抑瘤機(jī)制操软。

PD1抗體可以抑制腫瘤生長(zhǎng)。接受美洛昔康抗炎治療宪祥，手術(shù)組瘤體被抑制聂薪，非手術(shù)組沒(méi)有被抑制，提示美洛昔康通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)而抑制腫瘤的生長(zhǎng)蝗羊。

美洛昔康又是通過(guò)何種機(jī)制而影響腫瘤的生長(zhǎng)呢藏澳？美洛昔康可以引起腫瘤浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞（tumor infiltrated TAM）表型改變，他可以抑制TAM表面CD206的表達(dá)耀找，而CD206具有免疫抑制作用翔悠。但是同時(shí)美洛昔康會(huì)升高TAM表面的PD-L1，作者解釋為TAM升高的PD-L1是機(jī)體腫瘤免疫增強(qiáng)的標(biāo)志野芒。

總結(jié)

乳腺癌是全身性疾病蓄愁，診斷時(shí)已有大量癌細(xì)胞在原發(fā)灶之外定植，由于機(jī)體的CD8+T的免疫殺傷作用狞悲，遠(yuǎn)處定植的癌細(xì)胞一直處于CD8+T細(xì)胞的監(jiān)視之下撮抓，兩者處于動(dòng)態(tài)平衡。直至手術(shù)切除原發(fā)腫瘤摇锋，引發(fā)全身炎癥反應(yīng)丹拯，大量單核細(xì)胞轉(zhuǎn)移趨化至定植腫瘤細(xì)胞周圍，轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞荸恕，巨噬細(xì)胞表面的PD-L1可以抑制CD8+T的免疫殺傷作用乖酬。平衡被破壞，定植的腫瘤細(xì)胞爆發(fā)生長(zhǎng)融求，遠(yuǎn)處腫瘤復(fù)發(fā)剑刑。如果圍術(shù)期口服NSIADs抗炎鎮(zhèn)痛藥物，可以明顯降低早期腫瘤復(fù)發(fā)。（NSAID analgesic ketorolac used perioperatively may suppress early breast cancer relapse: Particular relevance to triple negative subgroup.Breast Cancer Res. Treat.134, 881–888 (2012）Reduction of breast cancer relapses with perioperative non-steroidal anti-inflammatory drugs: new findings and a review.Curr Med Chem.?2013;20(33):4163-76）施掏。