表觀轉(zhuǎn)錄組學：再探RNA

? ?為了找到新的思路，科學家們有時會查閱幾十年前發(fā)表的研究報告砚亭。這就是Wendy Gilbert最近在RNA修飾研究中所做的耘纱。轉(zhuǎn)運RNA（tRNAs）和信使RNA（mRNAs）富含腺嘌呤改基、胞嘧啶繁疤、鳥嘌呤和尿嘧啶的150多種修飾變體。假尿苷在rRNA和tRNA中含量豐富秕狰，但是當Gilbert在2013年開始她的研究時稠腊，沒有人知道這種修飾是否存在于mRNA中。

? ?身為耶魯大學副教授的Gilbert鸣哀，轉(zhuǎn)而查閱新澤西州羅氏研究中心（Roche Research Cente）的生物化學研究人員于1993年發(fā)表的一項研究架忌。在這項研究中，Andrey Bakin和James Ofengand給RNA中的假尿苷添加了一個龐大的化學基團我衬。他們發(fā)現(xiàn)叹放，這種超大型的假尿苷阻礙了逆轉(zhuǎn)錄酶介導RNA模板生成互補DNA（cDNA）的作用，阻礙了逆轉(zhuǎn)錄酶的運行挠羔。

? ?Gilbert和她的同事隨后將該方法應用于酵母細胞和人類細胞井仰，采用新一代測序技術（NGS）來檢測產(chǎn)生的cDNAs。他們在基因組中幾百個人類基因的轉(zhuǎn)錄本上檢測到由假尿苷引起的過早截短的cDNA信號破加。而在其他幾個課題組的實驗中俱恶，也同時出現(xiàn)了假尿苷的mRNA圖譜。這種修飾的出現(xiàn)并不僅僅是一種偶然范舀，它在mRNA上存在的水平隨著細胞壓力的變化而發(fā)生變化合是，這表明它具有調(diào)節(jié)作用。

? ?像Gilbert這樣的研究是在全基因組水平上研究修飾相關論文潮流的一部分锭环。除了涉及假尿苷的修飾外聪全，其他一些修飾也得到了特別關注，尤其是N6-甲基腺苷（m6A）辅辩，它在發(fā)育和疾病過程中對mRNA的調(diào)控起著關鍵作用难礼。應用于mRNA和長非編碼RNA研究的方法是新的，還有許多方法仍在理論測試階段蛾茉，并需要反復試錯來加以驗證臀稚。

? ?這些新方法也推動了新興的表觀轉(zhuǎn)錄組學領域的發(fā)展吧寺，表觀轉(zhuǎn)錄組學這是一個定義松散的術語散劫，它包括RNA修飾及其相關調(diào)節(jié)因子的生物學获搏〕Ｎ酰“在未來裸卫，你不會認為任何RNA分子僅僅是一種具有某種二級結(jié)構(gòu)的信息載體分子墓贿，”Christopher Mason如是說聋袋，他是紐約市威爾康奈爾醫(yī)學院的助理教授∈任辏“你會從如何修改代嗤、如何調(diào)控干毅、如何包裝以及如何控制等方面來考慮它們∫逃担”

轉(zhuǎn)向mRNA修飾

? ?與mRNAs相比渠鸽，tRNA和rRNA修飾的檢測研究是較為成熟的領域徽缚。畢竟凿试，這些非編碼RNA比mRNA含量更豐富，易于生化研究党瓮。尤其是tRNA可以進行質(zhì)譜分析盐类，它的體積小到足以讓研究人員將修飾的化學成分和它在序列中的位置一起鑒定出來枪萄。此外猫妙，許多研究者認為研究mRNA是一個更令人生畏的挑戰(zhàn)，因為它能改變細胞中那些巨大甚至稀有的功能分子逻悠。

? ?到目前為止童谒，對mRNA的修飾研究屈指可數(shù)饥伊。而其中一些備受爭議：研究人員爭論的焦點是它們的普遍性蔫饰，它們的生物學相關性，以及“判定”修飾位點的分析是否足夠嚴格篓吁。

? ?隨著現(xiàn)有技術的改進和新技術的發(fā)明茫因，該領域的一些開放性問題將得到解決杖剪。在用來發(fā)現(xiàn)新的修飾和探測現(xiàn)有修飾的方法中冻押，利用一些最成熟的抗體可以親和純化含有修飾的RNA盛嘿。

? ?2012年完成的一項研究通過使用抗體親和純化法洛巢，繪制了m6A的修飾譜圖，人們普遍認為這項研究開辟了一個新的領域次兆。在2012年之前稿茉，有證據(jù)表明m6A可能在mRNA調(diào)控中起關鍵作用。在許多真核生物中都發(fā)現(xiàn)了它漓库，例如在酵母產(chǎn)孢以及擬南芥組織分裂的過程中米苹，它在mRNA上的修飾水平升高。

? ?隨著NGS方法的出現(xiàn)陪汽，兩個研究小組對此進行了更深入的研究。一個是由Gideon Rechavi領導的舍巴醫(yī)療中心，它隸屬于以色列特拉維夫大學训挡；另一個團隊包括Mason和Samie Jaffrey澳骤。Samie Jaffrey是威爾康奈爾醫(yī)學院的藥理學教授，也是一家總部位于紐約的生物科技公司Gotham Therapeutics的共同創(chuàng)辦人澜薄。

? ?兩個研究團隊均使用m6A抗體親和純化含有該修飾的RNA片段为肮。然后他們利用這些片段創(chuàng)建了cDNA文庫并對其進行了測序，生成了一張潛在的m6A位點圖肤京。他們利用被稱為meRIP-Seq和m6A-seq的方法發(fā)現(xiàn)了數(shù)以千計的修飾颊艳。例如，Rechavi’s的小組在7000多個人類基因的轉(zhuǎn)錄本中發(fā)現(xiàn)了超過12000個m6A修飾位點忘分。m6A同樣存在于哺乳動物的長非編碼RNA中棋枕。

? ?研究者們已經(jīng)確定了與m6A相互作用的專用酶：“書寫者”負責將修飾添加到mRNA上，“閱讀者”負責實現(xiàn)其功能妒峦，而“擦除者”則負責移除這些修飾重斑。他們已經(jīng)證明了m6A通常是在應答刺激時調(diào)節(jié)mRNA的翻譯、穩(wěn)定性和剪接肯骇。在擬南芥中绸狐，m6A可以穩(wěn)定那些參與鹽和滲透脅迫反應應答的轉(zhuǎn)錄本。在哺乳動物中累盗，它似乎在學習和記憶寒矿、血細胞生成和X染色體失活等方面起作用。

? ?這些發(fā)現(xiàn)反映了進化史上可能有一個時期若债，那時RNA可能作為一個中心分子符相，一些生物學家稱之為“RNA世界”。Rechavi說，“我確信啊终，這將是基因表達調(diào)控的重要層面镜豹。”

“可成藥的領域”

? ?這些發(fā)現(xiàn)也有可能對現(xiàn)實世界產(chǎn)生影響蓝牲√酥“我們可以看到實際影響的初步成果，” Rechavi說例衍，他指出昔期，有幾項研究已經(jīng)將m6A修飾與癌癥聯(lián)系起來。例如佛玄，Tony Kouzaride和他的同事在英國劍橋大學格登研究所最近的一項研究表明硼一，m6A的書寫者——METTL3（甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白3）促進了急性髓系白血病細胞的生長。盡管大多數(shù)人對它們的存在保持沉默梦抢，但幾家生物技術初創(chuàng)公司正在進軍這一領域般贼。

? ?Kouzarides說：“這是一個有可能成藥的領域，而且其中有很好的靶點奥吩『咔”他也是英國劍橋Storm Therapeutics生物技術公司的共同創(chuàng)始人之一，該公司主要根據(jù)Kouzarides實驗室的研究結(jié)果開發(fā)產(chǎn)品霞赫。位于馬薩諸塞州劍橋市的Twentyeight-Seven Therapeutics公司人芽，主要專注于RNA研究，其創(chuàng)始人Richard Gregory解釋說绩脆，像METTL3這樣的潛在靶點在結(jié)構(gòu)上與DNA甲基化酶相似萤厅，而DNA甲基化酶正是現(xiàn)有癌癥藥物的靶點。Accent Therapeutics公司則位于馬薩諸塞州列克星敦市靴迫，其科學聯(lián)合創(chuàng)始人Chuan He表示惕味，該公司正在對幾種RNA修飾蛋白開展研究。

? ?同時玉锌，研究人員采用meRIP-Seq/m6A-seq方法去檢測其他修飾名挥，例如N1-甲基腺苷（m1A）以及最近發(fā)現(xiàn)的N4-乙酰胞苷（ac4C）。他們正在開發(fā)基于抗體的新一代技術主守，如Jaffrey和同事開發(fā)的miCLIP禀倔，用于檢測m6A。該方法主要通過將抗體交聯(lián)到RNA修飾上参淫，產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄酶的阻斷和cDNA的截短救湖。與meRIP-Seq/m6A-seq生成的100-200個堿基對讀取相比，該方法更精確地確定了修飾的位置涎才。

? ?Rechavi提示道鞋既，要使這種方法達到最優(yōu)效果力九，一是要將經(jīng)驗證的抗體很好的粘附在預期靶標上，二是盡量減少脫靶的結(jié)合邑闺。但在一個新方法和數(shù)據(jù)不斷受到挑戰(zhàn)的領域跌前，這只是其中一個問題。

數(shù)據(jù)的分歧

? ?在過去的幾年里陡舅，m6A和假尿苷的全轉(zhuǎn)錄組譜圖已經(jīng)產(chǎn)生抵乓，隨著綜合數(shù)據(jù)集變得越來越可靠，評估數(shù)據(jù)集質(zhì)量的研究正在興起靶衍。但是最近研究的一些修飾數(shù)據(jù)如m1A和2'-鄰甲基（Nm）-仍然是備受爭議灾炭。

? ?這個領域的大多數(shù)方法都“適合于在數(shù)字較低的一端發(fā)現(xiàn)一些共同之處，隨后意見就會出現(xiàn)分歧”摊灭，德國美因茨大學藥物化學研究院副教授Mark Helm說。

? ?當“對什么是信號與什么不是信號的解釋有很大不同”時败徊，就會產(chǎn)生爭議帚呼，海德堡的德國癌癥研究中心教授Michaela Frye補充道，他同時是Storm Therapeutics公司的一位顧問皱蹦。

? ?有幾篇綜述已經(jīng)解決了這樣的爭議煤杀，包括Helm、Jaffrey和其他人合著的論文沪哺。這些綜述概述了建立實驗質(zhì)控的方法沈自，使用正交法驗證結(jié)果，并確保更嚴格的數(shù)據(jù)分析辜妓。研究人員還呼吁枯途，進行更多的實驗來驗證RNA修飾位點是否是具有生物學功能的真實位點。例如籍滴，通過敲除或使用伊利諾伊州芝加哥大學Tao Pan小組開發(fā)的技術——SCARLET酪夷。SCARLET可以生化檢測和量化特定轉(zhuǎn)錄本中任何核苷酸的修飾殘基。然而孽惰，Gilbert說晚岭，這樣的驗證“幾乎從未完成過”。

? ?但是勋功，盡管任何新興領域都有這種反復坦报，但有一個共識是需要新的實驗方法。

舊的變成新的

? ?芝加哥大學的化學教授何川的研究目標是狂鞋，開發(fā)新的既可以定量又便于使用的表觀轉(zhuǎn)錄組方法片择。為了迎接這一挑戰(zhàn)，他獲得了國家人類基因組研究所為期五年骚揍、價值1060萬美元的資助构回。“該領域的主要需求是新技術”他說。

? ?研究人員最終希望找到一種方法纤掸，能夠精確地說明基因修飾在基因組上的位置脐供，同時也能量化mRNAs和非編碼RNAs中該修飾所占比例。具有這種潛力的方法包括對單個RNAs進行測序的新興技術借跪，例如納米孔測序政己，即用電流將RNA分子穿過膜上的一個小孔，然后通過測量電流的變化來讀取序列掏愁。

? ?由西班牙巴塞羅那基因組調(diào)控中心的Mason 和Eva Maria Novoa組成的團隊歇由，在BioRxiv上發(fā)表的一項新的研究，令人感興趣的是果港，用納米孔測序檢測m6A的準確率為90%沦泌。

? ?一些研究人員樂觀地認為，納米孔技術將大大提高精確度辛掠，但其他研究人員則持遲疑態(tài)度谢谦。“我喜歡這種方法萝衩，因為我認為它可以解決所有問題回挽，”Frye說，但她指出猩谊，檢測極為罕見的修飾是一個挑戰(zhàn)千劈，即使使用的方法只是稍稍有點不準確。

? ?其他更遠期的方法包括改進質(zhì)譜方法以應用于mRNA檢測牌捷，或提升成像技術墙牌，這些技術改良目前仍處于起步階段，Sara Rouhanifard說暗甥。她是在波士頓麻省理工學院生物工程專業(yè)的助理教授憔古。

? ?何川的課題組目前正在研究與二代測序或其他測序方法相串聯(lián)的技術×苄洌“希望在兩年內(nèi)鸿市，人們可以從一家公司購買一套包含‘多種方法’的試劑盒”，他說即碗，“然后使用他們可以下載的軟件焰情，做自己想做的任何事“粒”例如内舟，他的小組就應用定向進化的方法來產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄酶，將堿基改變引入cDNA初橘，以檢測不同的RNA修飾验游。

? ?與此同時鸽素，Gilbert仍在回看歷史碧信。她說瘾境，并非只有她一個人在審視舊的研究成果佛嬉，她想看看能用什么樣的方法“轉(zhuǎn)變成下一代測序分析技術，這將有助于找到新的修飾垒在∷馄牵”她還渴望探索RNA結(jié)合蛋白如何調(diào)節(jié)和闡釋假尿苷傳遞的信息，它似乎沒有專門的mRNA 閱讀者或者書寫者场躯，她補充道谈为。

當前和未來的工具

? ?越來越多的研究人員開始對表觀轉(zhuǎn)錄組技術表現(xiàn)出興趣，尤其是對m6A修飾踢关。

? ?已經(jīng)有一些試劑盒可以用于meRIP-Seq/m6A-seq方法（例如伞鲫，來自新英格蘭生物實驗室）。Jaffrey使用的是來自Abcam和Synaptic Systems的抗體签舞。Jaffrey補充說秕脓，其他技術，比如miCLIP瘪菌，需要更多的技巧撒会，他已經(jīng)發(fā)布了miCLIP和meRIP Seq的詳細實驗方案嘹朗。

? ?以色列雷霍沃特的魏茨曼科學研究所的RNA研究人員Schraga Schwartz指出深入研究數(shù)據(jù)需要計算生物學方面的專業(yè)知識师妙，盡管他相信隨著工具的發(fā)展，數(shù)據(jù)將變得更容易解釋屹培。對m6A感興趣的研究人員默穴，可以“大致了解數(shù)據(jù)是什么樣子的”，他說褪秀，但在不同條件下獲得可以定量比較的數(shù)據(jù)“要復雜得多”蓄诽。

? ?Mason鼓勵研究人員將他們的技能拓展到表觀轉(zhuǎn)錄組研究中來，“在生物學中媒吗，很少有這樣一個廣闊的領域等待被探索仑氛。在這種情況下，出現(xiàn)的問題是‘我的RNA修飾會影響我的某部分生物學功能嗎闸英？’到目前為止锯岖，答案似乎總是‘是的’「危”他說出吹，“我認為掌握這套技能的好處是，你可以很快點亮一道新的光線辙喂，從某個角度照亮你長期以來所關注的生物學問題捶牢，然后以新的方式看待它鸠珠。”■

（譯者李楠是中國科學院深圳先進技術研究院的副研究員）