這一篇筆記是有關(guān)于單細(xì)胞ATAC-seq的初步了解全闷。在閱讀相關(guān)文獻(xiàn)之前，我還是在網(wǎng)上找了些視頻來看潘鲫，想先對其有一個整體上的認(rèn)識翁逞。這里有一個比較好的視頻，講的很淺顯易懂次舌。供大家參考：Understanding Single-Cell ATAC-Seq and its Applications
首先來復(fù)習(xí)一下什么是ATAC-seq熄攘？全稱：Assay for Transposase Accessible Chromotin。用來研究基因組的可接近性彼念。是利用tn5轉(zhuǎn)座酶來實(shí)驗的挪圾。首先是從500-10k的細(xì)胞里提取DNA，把它們與Tn5（接有接頭的）一起孵育逐沙。Tn5會靶向那些容易接近的染色質(zhì)區(qū)域哲思，然后進(jìn)行切割，并把接頭接到上面吩案。之后把這些DNA片段進(jìn)行純化棚赔，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。之后測序徘郭。
那么ATAC-seq可以幫我們解決什么問題呢靠益？比如說：
（1）可以快速的鑒定出epigenetics是否對你的處理產(chǎn)生了應(yīng)答。如果你沒有組蛋白修飾的candidates残揉，或者你也不知道哪些轉(zhuǎn)錄因子起調(diào)控作用胧后，你就應(yīng)該首先考慮先拿到epigenetics landscape。
（2）根據(jù)開放的染色質(zhì)區(qū)域抱环，可以推斷出哪些染色質(zhì)修飾是我們感興趣的壳快。
（3）根據(jù)開放的染色質(zhì)區(qū)域，可以預(yù)測哪些轉(zhuǎn)錄因子可能結(jié)合在這些區(qū)域镇草，從而調(diào)控細(xì)胞“命運(yùn)”眶痰、疾病以及對藥物的應(yīng)答。
（4）預(yù)測潛在的pathway調(diào)節(jié)機(jī)制梯啤。
上面講了ATAC-seq可以為我們解決的問題竖伯。但是它仍然有一些局限性：
（1）ATAC-seq的輸出的數(shù)值是樣品里所有細(xì)胞的平均值。比如上圖展示了一段染色質(zhì)在CD33基因附近的開放情況。你從這個圖上沒有辦法區(qū)分是哪一群細(xì)胞誘導(dǎo)了這種應(yīng)答黔夭。
（2）如果你想要研究的細(xì)胞群在整個樣品里只占一很小部分宏胯，那么你在使用流式對其分選的過程也是非常的耗時，并且會引入一些操作上的影響本姥。
所以你的目的細(xì)胞是一群很rare的細(xì)胞群肩袍，那么scATAC-seq會幫你解決上面這個問題。
什么是scATAC-seq婚惫？它的原理和標(biāo)準(zhǔn)的ATAC-seq的方法一樣氛赐，也是利用Tn5轉(zhuǎn)座酶來實(shí)現(xiàn)的。只不過結(jié)合了barcode來對每一個細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記先舷，這樣就可以從單細(xì)胞水平來看染色質(zhì)的開放情況了艰管。目前主要有兩種平臺，一是結(jié)合細(xì)胞index的技術(shù)蒋川；另一種是基于液滴技術(shù)牲芋。
對于細(xì)胞indexing方法：同樣你需要先分離細(xì)胞，把細(xì)胞分到96孔板里捺球，然后用接了barcode的Tn5孵育缸浦。這樣細(xì)胞核就被“貼上標(biāo)簽”了。然后把這些標(biāo)記了的nuclei混到一起進(jìn)行稀釋氮兵，重新分配到新的96孔板里裂逐，使得每一個孔里有15-25個細(xì)胞，每一個孔就成為一個pool泣栈，之后用PCR擴(kuò)增這些pool卜高，進(jìn)行測序。
基于液滴的方法：與傳統(tǒng)的ATAC-seq的方法差不多南片，只不過裂解的過程在微滴里進(jìn)行掺涛。
這里主講人重點(diǎn)講解了10xGenomics平臺的scATAC-seq流程。首先將nuclei與Tn5孵育疼进，然后通過一個微滴設(shè)備（10xGenomics controller）與gel beads融合薪缆，如果你放大看這些gel beads，每一個gel beads都接了一段oligo颠悬，這個barcode是唯一的，所以當(dāng)細(xì)胞與這個帶有barcode的微滴融合時定血，每一個細(xì)胞都被接上了唯一的標(biāo)簽赔癌，方便后續(xù)我們可以知道哪些signal是來自哪一個細(xì)胞的。之后進(jìn)行l(wèi)inear擴(kuò)增澜沟，把oil去除灾票，將這些barcodes片段混成pool以便后續(xù)文庫制備。
scATAC-seq使用tSNE/UMAP來展示結(jié)果茫虽。比如上圖的例子刊苍，左上角的峰圖是傳統(tǒng)ATAC-seq的結(jié)果既们，顯示的是所有細(xì)胞的平均輸出的信號。而在單細(xì)胞的tSNE/UMAP結(jié)果里正什，每一種顏色代表一個細(xì)胞群啥纸，這個細(xì)胞群里的所有細(xì)胞有著相同的染色質(zhì)開放區(qū)域。上面右圖則是每一個細(xì)胞群在Slc12a3基因附近的染色質(zhì)開放情況婴氮，這就可以鑒定出哪些細(xì)胞群在這個位置是特異開放的斯棒。這個方法非常適合那些異質(zhì)性高的樣品，特別是腫瘤微環(huán)境主经。
單細(xì)胞ATAC-seq可以解決什么科學(xué)問題荣暮？
（1）鑒定異質(zhì)性細(xì)胞群里的不同類型的細(xì)胞
（2）幫助我們理解腫瘤微環(huán)境的構(gòu)成：
比如：
a)腫瘤微環(huán)境里有哪些類型的細(xì)胞
b)哪些群體對藥物或者其他處理產(chǎn)生應(yīng)答
（3）在發(fā)育過程中，鑒定細(xì)胞分化和細(xì)胞“軌跡”
（4）構(gòu)建發(fā)育過程中或者疾病過程里的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)罩驻。
這里主講人舉了個例子：單細(xì)胞的ATAC-seq的一個優(yōu)點(diǎn)穗酥，是它可以不依賴于marker基因來鑒定不同細(xì)胞群。有一篇文獻(xiàn)就是利用scATAC-seq來描述人類血細(xì)胞生成過程中的染色體的landscape惠遏。文獻(xiàn)的作者收集了骨髓和血液樣品進(jìn)行了scATAC-seq實(shí)驗砾跃。它們發(fā)現(xiàn)了從血細(xì)胞生成的最初階段到最終階段存在31種不同的細(xì)胞類型，或者說細(xì)胞clusters爽哎。如果深入挖掘蜓席，它們發(fā)現(xiàn)了每一個細(xì)胞類型的順式調(diào)控因子。發(fā)現(xiàn)了每一個細(xì)胞類型相關(guān)的增強(qiáng)子和啟動子并繪制了熱圖课锌。它們還揭示了plasma B細(xì)胞的分化“軌跡”中每一個階段的調(diào)控因子厨内。
另一個例子就是利用單細(xì)胞ATAC-seq對腫瘤微環(huán)境的分析。樣品是來自basal cell carcinoma的患者渺贤，這些患者接受了PD-1抑制劑免疫治療雏胃。scATAT-seq可以區(qū)分微環(huán)境里的免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞志鞍、腫瘤細(xì)胞（UMAP plot）瞭亮。文獻(xiàn)作者發(fā)現(xiàn)所有的基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞都集中在一起（不同的患者之間），而腫瘤細(xì)胞則被清楚的分成4個clusters固棚，并且每一個病人里都是specific的统翩。而上圖右邊的峰圖，展示了幾個與T細(xì)胞活性相關(guān)的基因附近的染色質(zhì)可接近情況此洲〕Ш梗可以看到在不同的腫瘤細(xì)胞群中，這幾個基因的可接近性是不同的呜师。并且腫瘤細(xì)胞群與基質(zhì)細(xì)胞群在這幾個基因附近的可接近性也有很大的不同娶桦。
但是目前scATAC-seq技術(shù)還存在很多挑戰(zhàn)，比如：
（1）lysis的實(shí)驗條件（可能對于不同細(xì)胞和組織來說都是specific的）
（2）組織分離的條件
（3）你需要比較大型的儀器，比如流式分選
（4）測序比較昂貴
