真核生物大部分基因含有內(nèi)含子鳄哭，轉(zhuǎn)錄完成后產(chǎn)生的mRNA前體需要經(jīng)過一系列復(fù)雜的加工泰佳，成為成熟的mRNA，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中才能發(fā)揮功能闻坚」料瑁可變剪接（Alternative Splicing，AS）是指從一個(gè)mRNA前體中通過不同的剪接方式窿凤，對(duì)外顯子和內(nèi)含子進(jìn)行組合仅偎，產(chǎn)生不同的mRNA剪接異構(gòu)體的過程■ㄊ猓可變剪接受到具有特殊結(jié)構(gòu)域的順式調(diào)控元件（RNA motif）和識(shí)別這些motif的RNA結(jié)合蛋白（RNA binding protein）調(diào)控 橘沥。RNA-seq通常是二代轉(zhuǎn)錄組，可以通過高深度的測(cè)序數(shù)據(jù)組裝構(gòu)建轉(zhuǎn)錄本序列夯秃，預(yù)測(cè)外顯子與內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)并識(shí)別出可變剪接模式座咆，假陽性不小。相比之下仓洼，三代全長轉(zhuǎn)錄組利用其讀長更長的優(yōu)勢(shì)介陶，可以直接讀取轉(zhuǎn)錄本的全長序列，無需打斷色建、組裝哺呜，直接獲得全長轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)信息，能夠更加準(zhǔn)確的分析生物體內(nèi)存在可變剪接事件镀岛。選擇哪種測(cè)序方式需要考慮實(shí)際情況綜合考慮弦牡。
rMATS
rMATS是一款對(duì)RNA-Seq數(shù)據(jù)進(jìn)行差異可變剪切分析的軟件友驮。其通過rMATS統(tǒng)計(jì)模型對(duì)不同樣本（有生物學(xué)重復(fù)的）進(jìn)行可變剪切事件的表達(dá)定量，然后以likelihood-ratio test計(jì)算P value來表示兩組樣品在IncLevel（Inclusion Level）水平上的差異(從公式上來看驾锰，IncLevel跟PSI的定義也是類似的)卸留，lncLevel并利用Benjamini Hochberg算法對(duì)p value進(jìn)行校正得FDR值。
安裝
conda activate py2
conda install rmats
conda install rmats2sashimiplot
運(yùn)行
mkdir -p $output/4.4.4_rmats
echo $output/4.3.1_Tophat2/A_rep1.uniq.sorted.bam,$output/4.3.1_Tophat2/A_rep2.uniq.sorted.bam,$output/4.4.1_Tophat2/A_rep3.uniq.sorted.bam>$output/4.4.4_rmats/A.txt
echo $output/4.4.1_Tophat2/B_rep1.uniq.sorted.bam,$output/4.4.1_Tophat2/B_rep2.uniq.sorted.bam,$output/4.4.1_Tophat2/B_rep3.uniq.sorted.bam>$output/4.4.4_rmats/B.txt
mkdir -p $output/4.4.4_rmats/A_vs_B
rmats.py --b1 $output/4.4.4_rmats/A.txt --b2 $output/4.4.4_rmats/B.txt --gtf $dir_geo/4_Bowtie2/XXX.genome.gtf --od $output/4.4.4_rmats/A_vs_B -t paired --readLength 125 --cstat 0.0001 --nthread 6 --tmp $output/4.4.4_rmats/A_vs_B
mkdir -p $output/4.4.5_rmats2sashimiplot/
mkdir -p $output/4.4.5_rmats2sashimiplot/A_vs_B
rmats2sashimiplot --b1 $output/4.4.1_Tophat2/A.uniq.sorted.bam,$output/4.4.1_Tophat2/A_rep2.uniq.sorted.bam,$output/4.4.1_Tophat2/A_rep3.uniq.sorted.bam --b2 $output/4.4.1_Tophat2/B_rep1.uniq.sorted.bam,$output/4.4.1_Tophat2/B_rep2.uniq.sorted.bam,$output/4.4.1_Tophat2/B_rep3.uniq.sorted.bam -t SE -e $output/4.4.4_rmats/A_vs_B/SE.MATS.JC.txt --l1 A --l2 B --exon_s 1 --intron_s 1 -o $output/4.4.5_rmats2sashimiplot/A_vs_B
結(jié)果
MATS的結(jié)果文件是以各個(gè)可變剪切事件的分布的椭豫，主要由AS_Event.MATS.JC.txt耻瑟，AS_Event.MATS.JCEC.txt，fromGTF.AS_Event.txt赏酥，JC.raw.input.AS_Event.txt喳整，JCEC.raw.input.AS_Event.txt這幾類；其中JC和JCEC的區(qū)別在于前者考慮跨越剪切位點(diǎn)的reads裸扶，而后者不僅考慮前者的reads還考慮到比對(duì)到?jīng)]有跨越剪切位點(diǎn)的reads框都，但一般僅使用最重要的.Event.MATS.JC.txt的結(jié)果（如果只是單純的比較兩組樣品間可變剪切的差異的話；最后采用rmats2sashimiplot對(duì)結(jié)果繪圖呵晨。
ASprofile
ASprfile軟件對(duì)由StringTie對(duì)Hisat2的比對(duì)結(jié)果進(jìn)行拼接的結(jié)果文件獲取每個(gè)樣本存在的可變剪接類型及相應(yīng)表達(dá)量魏保。
安裝
wget https://ccb.jhu.edu/software/ASprofile/ASprofile.tar.gz
tar -zxvf ASprofile.tar.gz
cd ASprofile.*
