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作業(yè)要求
需要用安裝好的sratoolkit把sra文件轉換為fastq格式的測序文件，并且用fastqc軟件測試測序文件的質量损俭！
作業(yè)泳姐，理解測序reads，GC含量梧乘，質量值绊序，接頭茴迁，index孔飒，fastqc的全部報告灌闺，搜索中文教程，并發(fā)在論壇上面坏瞄。
來源于生信技能樹：http://www.biotrainee.com/forum.php?mod=viewthread&tid=1750#lastpost
實驗步驟
1. 將 sra 數(shù)據轉化成 fastq 格式（先把所有的sra放到一個文件夾里桂对，姑且命名為SRR，然后 cd ~/SRR進入這個文件夾）
for i in {56..62}
do
fastq-dump --gzip --split-3-O /Users/chengkai/Desktop/zhuanlu_files -A SRR35899${i}.sra
done
--gzip 壓縮格式為gzip
--split-3 如果是雙端測序輸出兩個文件鸠匀，如果不是只輸出一個文件
-0 輸出文件路徑
“/Users/chengkai/Desktop/zhuanlu_files” 這里改成你自己的文件路徑
-A 輸入文件路徑
搞定之后蕉斜，會生成兩個文件，列舉其中一個 SRR3589956.sra_1.fastq.gz
然后所有的文件再放入另外一個文件夾（姑且命名SRA)缀棍，然后在cd ~/SRA進入這個文件夾里面
for i in `seq 56 62`
> do
> fastqc SRR35899${i}.sra_1.fastq.gz
> done
或者 fastqc SRR35899${i}.sra_1.fastq.gz
質量解讀
html 格式用瀏覽器打開
基本信息
Enconding: 測序平臺版本號
Total Sequence: reads 的數(shù)量
Sequence length: 總的序列數(shù)
%GC GC比宅此，這個指標有物種意義，用于區(qū)別物種睦柴，一般人類42%
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每個read各位置堿基的測序質量
橫軸堿基的位置（1-51）诽凌，縱軸是質量分數(shù)毡熏，20表示1%的錯誤率坦敌，30表示0.1%
紅色線代表中位數(shù)，藍色代表平均數(shù)痢法，黃色是25%-75%區(qū)間狱窘，觸須是10%-90%區(qū)間
Warning 報警 如果任何堿基質量低于10,或者是任何中位數(shù)低于25
Failure 報錯 如果任何堿基質量低于5,或者是任何中位數(shù)低于20
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偏離度
橫軸堿基的位置（1-51）
縱軸是tail的Index編號
檢查reads中每一個堿基位置在不同的測序小孔之間的偏離度，藍色代表偏離度小财搁，質量好蘸炸，越紅代表偏離度越大，質量越差尖奔。
這個圖主要是為了防止搭儒，在測序過程中穷当，某些tail受到不可控因素的影響而出現(xiàn)測序質量偏低
image.png
reads質量的分布
橫軸表示Q值，0-40
縱軸是每個值對應的reads數(shù)目
當峰值小于27時淹禾，警告馁菜；當峰值小于20時，fail铃岔。我的報告峰值在38
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GC 含量統(tǒng)計
橫軸堿基的位置（1-51）
縱軸是堿基含量百分比
圖中四條線代表A T C G在每個位置平均含量
當部分位置堿基的比例出現(xiàn)bias時汪疮，即四條線在某些位置紛亂交織，往往提示我們有overrepresented sequence的污染毁习。
本結果前10個位置智嚷，每種堿基頻率有明顯的差別，說明有污染纺且。
當任一位置的A/T比例與G/C比例相差超過10%盏道，報"WARN"；當任一位置的A/T比例與G/C比例相差超過20%隆檀，報"FAIL"
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序列平均GC含量分布圖
橫軸是百分比摇天； 縱軸是每條序列GC含量對應的數(shù)量
藍色的線是程序根據經驗分布給出的理論值，紅色是真實值恐仑，兩個應該比較接近才比較好
當紅色的線出現(xiàn)雙峰泉坐，基本肯定是混入了其他物種的DNA序列
偏離理論分布的reads超過15%時，報"WARN"裳仆；偏離理論分布的reads超過30%時腕让，報"FAIL"
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各位置N的reads比率
當測序儀器不能辨別某條reads的某個位置到底是什么堿基時，就會產生“N”歧斟，統(tǒng)計N的比率
正常情況下纯丸，N值非常小
當任意位置的N的比例超過5%，報"WARN"静袖；當任意位置的N的比例超過20%觉鼻，報"FAIL"
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reads 長度分布
每次測序儀測出來的長度在理論上應該是完全相等的
當reads長度不一致時報"WARN"；當有長度為0的read時報“FAIL”
當測序的長度不同時队橙，如果很嚴重坠陈，則表明測序儀在此次測序過程中產生的數(shù)據不可信
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統(tǒng)計不同拷貝數(shù)的reads的頻率
橫坐標是duplication的次數(shù)，縱坐標是duplicated reads的數(shù)目,以unique reads的總數(shù)作為100%
測序深度越高捐康，越容易產生一定程度的duplication仇矾，這是正常的現(xiàn)象，但如果duplication的程度很高解总，就提示我們可能有bias的存在
當非unique的reads占總數(shù)的比例大于20%時贮匕，報"WARN"；當非unique的reads占總數(shù)的比例大于50%時花枫，報"FAIL"
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接頭含量
此圖衡量的是序列中兩端adapter的情況
如果在當時fastqc分析的時候-a選項沒有內容刻盐，則默認使用圖例中的四種通用adapter序列進行統(tǒng)計
本例中adapter都已經去除掏膏，如果有adapter序列沒有去除干凈的情況，在后續(xù)分析的時候需要先使用cutadapt軟件進行去接頭
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重復短序列
這個圖統(tǒng)計的是敦锌，在序列中某些特征的短序列重復出現(xiàn)的次數(shù)
我們可以看到1-8bp的時候圖例中的幾種短序列都出現(xiàn)了非常多的次數(shù)壤追，一般來說，出現(xiàn)這種情況供屉，要么是adapter沒有去除干凈行冰，而又沒有使用-a參數(shù)；要么就是序列本身可能重復度比較高伶丐，如建庫PCR的時候出現(xiàn)了bias
對于這種情況悼做，我的辦法是可以cut掉前面的一些長度，可以試著cut 1bp
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參考文獻
http://fbb84b26.wiz03.com/share/s/3XK4IC0cm4CL22pU-r1HPcQQ2irG2836uQYm2iZAyh1Zwf3_（青山屋主）
www.biotrainee.com/thread-2034-1-1.html(laofuzi)
