限制性內(nèi)切酶酶切注意事項
在進(jìn)行限制性酶切反應(yīng)過程中，影響限制性酶切反應(yīng)效果的因素較多缀棍，要設(shè)計酶切反應(yīng)宅此，一般均應(yīng)考慮諸如酶切系統(tǒng)、溫度條件爬范、反應(yīng)體積父腕、底物性質(zhì)及星型反應(yīng)等因素。根據(jù)各種不同的條件青瀑，酶切反應(yīng)的設(shè)計一般應(yīng)注意以下問題：
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大多數(shù)限制酶貯存在50％甘油溶液中璧亮，以避免在-20℃條件下結(jié)冰。當(dāng)最終反應(yīng)液中甘油濃度大于12％時斥难，某些限制酶的識別特異性降低枝嘶，從而產(chǎn)生星活性，更高濃度的甘油會抑制酶活性蘸炸。因此加入反應(yīng)的酶體積不超過反應(yīng)總體積的1/10躬络，避免限制酶活性受到甘油的影響。
濃縮的限制酶可在使用前用1×限制酶緩沖液稀釋搭儒，但切勿用水稀釋以免酶失活穷当，用水稀釋的酶不能長期保存提茁。
反應(yīng)體系中Mg2+是限制酶僅有的共同因子，當(dāng)用其它二價陽離子代替Mg2+或加入能螯合Mg2+的EGTA或EDTA時馁菜，酶活性會被抑制茴扁，或改變酶的特異性，導(dǎo)致星型反應(yīng)汪疮。
多種因素可引發(fā)星型反應(yīng)：①非最適的pH峭火；②Co2+、Mn2+智嚷、2n2+取代Mg2+卖丸；③酶濃度大于25u/ug；④鹽濃度降低盏道；⑤高濃度甘油的存在(>12%)稍浆；⑥有機(jī)溶劑的存在。
反應(yīng)混合物中DNA底物的濃度不宜太大猜嘱，小體積中過高濃度的DNA會形成粘性DNA溶液抑制酶的擴(kuò)散衅枫，并降低酶活性。建議酶切反應(yīng)的DNA濃度為0.1-0.4ug/ul朗伶。
酶切反應(yīng)所加入的酶量應(yīng)適中弦撩，根據(jù)底物的種類、量的多少和體積的大小而定论皆，對不同的限制酶益楼，各廠家均有一最大的消化量指標(biāo)可參考。
當(dāng)要用兩種或兩種以上限制酶切割DNA時点晴，如果這些酶可以在同種緩沖液中作用良好偏形，則兩種酶可同時切割，如果這些酶所要求的緩沖液有所不同觉鼻，則可采用以下兩種替代方法：
①先用在低離子強(qiáng)度的緩沖液中活性高的酶切割DNA，然后加入適量NaCl及第二種酶队橙，繼續(xù)反應(yīng)坠陈；
②使用能夠使多數(shù)內(nèi)切酶均表現(xiàn)較高活性的單種緩沖液。
用同一種酶切割不同的DNA時捐康，所需酶量不同仇矾，可根據(jù)DNA底物上酶切位點的多少與λDNA存在位點的數(shù)目比較后，決定用酶量解总。對于超螺旋DNA贮匕，基因組DNA、瓊脂糖包埋的DNA花枫，使用的酶單位活性應(yīng)適當(dāng)加大刻盐。
反應(yīng)混合液中加入濃度為0.1mg/ml的BSA掏膏，可維持酶的穩(wěn)定性。
10.酶切底物DNA應(yīng)具備一定的純度敦锌，其溶液中不能含有跡量酚馒疹、氯仿、乙醚乙墙，大于10mM的EDTA颖变，去污劑SDS以及過量的鹽離子濃度，否則會不同程度地影響限制酶的活性听想。
11.DNA堿基上的甲基化修飾也是影響酶切的一個重要因素腥刹，所以轉(zhuǎn)化實驗所選擇的受體菌株應(yīng)考慮到使用的菌株中的酶修飾系統(tǒng)。
12.要保證酶作用時的最佳反應(yīng)條件(ph, 溫度)和底物用量汉买，酶反應(yīng)才能有效地進(jìn)行衔峰。
13.反應(yīng)取酶時應(yīng)使用無菌吸頭，以免污染酶液录别，同時應(yīng)盡量縮短酶在溫室的放置時間朽色。
14.高于37℃或需長時間保溫時，可加入礦物油覆蓋在反應(yīng)液上以減少水分蒸發(fā)组题。
15.反應(yīng)混合物混勻時葫男，應(yīng)避免強(qiáng)烈振蕩以保證不使內(nèi)切酶變性及DNA大分子的完整。
16.反應(yīng)前的低速離心是必要的崔列，這可使因混勻吸附于管壁上的液滴全部沉至管底梢褐。
17.用已硅化的離心管進(jìn)行酶切反應(yīng)，可獲得更佳的酶切效果赵讯，否則DNA可能粘附于管壁而影響酶切效果盈咳。
18.終止酶反應(yīng)可根據(jù)需要采用不同的方法：
①酶切后不需進(jìn)行下一步反應(yīng)，可加入含EDTA的終止液終止反應(yīng)边翼；
②若需進(jìn)一步反應(yīng)(如連接鱼响，切割等)，可將反應(yīng)管置65℃保溫20-30分鐘组底，以滅活酶終止反應(yīng)丈积。
③可用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀獲得較純DNA進(jìn)行下一步酶學(xué)操作债鸡。
- 不同廠家的試劑不可混用江滨，需要時請查明相關(guān)條件及數(shù)據(jù)。
二厌均、限制性酶解中常見的問題及解決措施：
限制性酶切割DNA底物的操作過程中唬滑，會出現(xiàn)一些問題西土，產(chǎn)生的原因主要為酶解體系中各要素處于非最佳狀態(tài)捧颅，包括DNA的純度和特性，反應(yīng)緩沖液、反應(yīng)體積堪伍、反應(yīng)時間及溫度等妥色。
酶切反應(yīng)的注意點：
1 20ul體系是最佳體系
2 20ul體系最多切2ug的DNA
3 甘油的量最好是低于體系的5%拆魏，最大不超過10%
4 酶切效率和酶的質(zhì)量气筋，保護(hù)堿基，酶切位點的位置（同一段DNA不同位置可以差很遠(yuǎn)连锯，就算是都在中間也是一樣的）归苍，酶切位點狀態(tài)（如位點及周圍幾個堿基是否被甲基化等，有些甲基化后切不開运怖，有些恰好相反拼弃。DAN的空間結(jié)構(gòu)、識別序列的側(cè)翼序列摇展、DNA來源也有影響）酶的量吻氧，DNA的量，體系的純凈度（比如雜質(zhì)的干擾咏连，很多雜質(zhì)如乙醇等可以明顯抑制酶活性,另外還有DNase盯孙，蛋白質(zhì)，EDTA祟滴，SDS振惰，鹽離子，酚氯仿）垄懂，buffer的選擇骑晶，是否加BSA,DNA 的狀態(tài)（比如超螺旋狀態(tài)DNA酶切效率低5倍－－這也是不能1ug質(zhì)粒用1u酶切的原因，也不能只切1h的原因）草慧，星號活力等（也是因為雜質(zhì)干擾或者甘油太多桶蛔，buffer不合適，酶活性不穩(wěn)定）
5 一般不好的酶需要8倍的酶量漫谷，切2－4h仔雷。如果是比較好的酶可以4倍酶量切2－4h，甚至可以一倍酶量切10h以上舔示。 做的不好的酶一來有雜質(zhì)酶污染朽寞，切久了污染的酶產(chǎn)生的影響會很明顯，相對的酶量用大些引起的雜質(zhì)酶切割問題要小些斩郎，所以采用大酶量短時間。 二來不好的酶不穩(wěn)定喻频，時間長了識別位點會發(fā)生變化缩宜，造成亂切的情況。所以采用了大酶量短時間的方法，雖然有些浪費锻煌。 而比較好的酶則相反妓布。
注意酶加BSA目的一可以穩(wěn)定酶，低濃度酶容易降解宋梧。二可以減少管臂對酶非特異吸附匣沼。
最好用孵箱不要用水浴箱，因為國產(chǎn)貨不穩(wěn)一不小心就39去了捂龄，對酶活性殺傷較大释涛，孵箱至少不會突然很熱了
