原生質(zhì)體制備
- 材料
（1）正常生長的擬南芥葉片（7-10片）粗合，3-5周的植株。
（2）兩種膠帶幅垮，原膠帶固定上表皮腰池，透明膠帶固定下表皮。
（3）酶解液試劑：10mL，pH5.7
1% cellulose 0.1g
0.25% macerozyme 0.025g
0.4M甘露醇 0.782g
10mM氯化鈣 0.011g
20mM氯化鉀 0.0149g
0.1%BSA 0.01g
20mM MES 0.0426g
- 撕掉表皮后將葉片泡入有酶液的培養(yǎng)皿（慢慢搖示弓，40rpm）讳侨，20-60分鐘。
- 將protoplast 100g 離心3min奏属，用25mL W5重懸洗滌2遍跨跨，冰浴30min。
（試劑100mL W5（pH5.7）：154mM氯化鈉-0.9g拍皮，125mM氯化鈣-1.39g歹叮，5mM氯化鉀-0.037g跑杭，5mM葡萄糖-0.09g铆帽，2mM MES-0.00426g）
- 冰浴時，用紅細(xì)胞計數(shù)器計算原生質(zhì)體的數(shù)量德谅。
- 冰浴結(jié)束爹橱，離心（100gХ3min），MMG溶液重懸（使數(shù)量為2-5x105/m2細(xì)胞）窄做，體積看時冰浴結(jié)束愧驱。
（100mL MMG（pH5.7）: 0.4M甘露醇 7.28g，15mM氯化鎂 0.3045g椭盏，4mM MES 0.0852g）
原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化
- 0.2mL MMG溶液（原生質(zhì)體）组砚，混合30μg質(zhì)粒（室溫），加入等體積的現(xiàn)配的PEG溶液（40%（W/V）掏颊，0.1M氯化鈣糟红，0.2M甘露醇），室溫放置5min乌叶。
- 緩慢加入3mL W5盆偿，輕輕混勻，100g*1min准浴。
- 去上清事扭，重新用W5洗2遍，最后用1mL W5重懸
- 將其轉(zhuǎn)入6孔板中（6孔板已用1%BSA覆蓋乐横，防止貼壁）求橄，室溫放置16小時。
試劑PEG4000 溶液：50mL（pH5.7）葡公，PEG400：40%（W/V）：20g罐农，0.1M氯化鈣：0.555g，0.2M甘露醇：1.82g
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