Resolution of Cell Fate Decisions Revealed by Single-Cell Gene Expression Analysis from Zygote to Blastocyst

利用單細(xì)胞基因表達(dá)分析揭示從受精卵到胚泡細(xì)胞命運(yùn)決定的解析

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作者程涼皮老師文章點(diǎn)評(píng)2010年湯老師與郭老師的研究（（湯富酬老師2009年的文章使得單細(xì)胞測(cè)序成為現(xiàn)實(shí)，郭國(guó)驥老師2010年的文章揭示對(duì)500多個(gè)細(xì)胞進(jìn)行48個(gè)基因的單細(xì)胞RT-qPCR就可以進(jìn)行細(xì)胞類型區(qū)分棘幸，使得單細(xì)胞測(cè)序方向轉(zhuǎn)向大量細(xì)胞低深度測(cè)序）），可以應(yīng)用單細(xì)胞基因表達(dá)分析去揭示發(fā)育機(jī)制，可廣泛用于其他生物系統(tǒng)。

閱讀目的

了解單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組骨灰級(jí)玩家郭國(guó)驥老師是如何在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)的門虛掩的時(shí)候推動(dòng)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組研究的惹资，作者做這個(gè)研究的原因填物、目的以及具體設(shè)計(jì)思路與實(shí)驗(yàn)思路）

答：做這個(gè)研究的主要原因是除了郭老師自身的專業(yè)之外，還要結(jié)合目前植入前胚胎發(fā)育存在的現(xiàn)象（見概述最后一段肖抱，存在共轉(zhuǎn)錄因子，需要更明確的確定异旧，于是郭老師就想找各個(gè)階段48個(gè)關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平的差異表達(dá)意述，從而為發(fā)育中的小鼠胚胎的最早細(xì)胞命運(yùn)決定提供了前所未有的洞察力）

文獻(xiàn)概要

小鼠胚泡內(nèi)64細(xì)胞期存在三種不同的細(xì)胞類型。研究人員已經(jīng)使用超過500個(gè)細(xì)胞的單細(xì)胞表達(dá)分析研究了直到這個(gè)階段的細(xì)胞發(fā)育。分析的48個(gè)基因部分是基于對(duì)800多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的全胚胎分析選擇的荤崇。研究人員表明拌屏，在桑椹胚中，卵裂球共表達(dá)不同種類的特異性轉(zhuǎn)錄因子术荤，但是通過64細(xì)胞期倚喂，可以根據(jù)它們的定量表達(dá)譜清楚地區(qū)分三種細(xì)胞類型。我們確定Id2和Sox2分別是外細(xì)胞和內(nèi)細(xì)胞的最早標(biāo)記喜每。隨后是早期內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中受體-配體對(duì)Fgfr 2/Fgff 4表達(dá)的反向相關(guān)性务唐。位置和信號(hào)事件似乎先于轉(zhuǎn)錄程序的成熟。這些結(jié)果說明了單細(xì)胞表達(dá)分析對(duì)發(fā)育機(jī)制的洞察能力带兜。這項(xiàng)技術(shù)應(yīng)該廣泛應(yīng)用于其他生物系統(tǒng)枫笛。

名詞背景

[if !supportLists]l?[endif]64細(xì)胞期（桑葚胚64個(gè)細(xì)胞，分裂到囊胚有128細(xì)胞）

[if !supportLists]l?[endif]小鼠植入前胚胎發(fā)育（內(nèi)細(xì)胞團(tuán)是一群偏離中心刚照、集中在“極滋養(yǎng)層”下方的細(xì)胞刑巧。孵出后，囊胚附著于子宮壁上无畔，并陷入子宮壁內(nèi)啊楚，吸收母體營(yíng)養(yǎng)并排除代謝物，這個(gè)過程稱為著床或植入浑彰。）

[if !supportLists]l?[endif]在著床（植入）之前恭理，胚胎由三種不同的細(xì)胞類型組成，滋養(yǎng)外胚層郭变、原始內(nèi)胚層和外胚層

[if !supportLists]l?[endif]TE 滋養(yǎng)外胚層PE 原始內(nèi)胚層 ?EPI外胚層 ICM內(nèi)細(xì)胞團(tuán)

[if !supportLists]l?[endif]主成分分析在高維空間中獲取數(shù)據(jù)點(diǎn)颜价，并定義穿過該空間的新軸(分量)，使得第一個(gè)分量捕獲數(shù)據(jù)中盡可能多的方差诉濒，第二個(gè)分量(與第一個(gè)正交)捕獲盡可能多的剩余方差周伦，等等。

思考

1.500個(gè)直到這個(gè)階段的細(xì)胞郭老師是如何取的未荒，具體這500個(gè)細(xì)胞是處于什么階段专挪？作者是如何基于800多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，選出48個(gè)基因的片排，為什么挑選的是48個(gè)基因呢寨腔？

答：由于TFs對(duì)于確定細(xì)胞類型特異性表型至關(guān)重要，所以研究人員首先建立了一個(gè)高質(zhì)量的數(shù)據(jù)集（可以用于預(yù)測(cè)細(xì)胞類型特異性）率寡，其中包含了這些調(diào)控分子的一整套植入前表達(dá)動(dòng)力學(xué)迫卢。先從植入相關(guān)131，845個(gè)表達(dá)序列標(biāo)簽中所代表的轉(zhuǎn)錄因子找出2348個(gè)預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄因子勇劣，再與EST相關(guān)找出885個(gè)(38%)個(gè)，接著再從胚胎干細(xì)胞和滋養(yǎng)層干細(xì)胞文庫產(chǎn)生的無害環(huán)境技術(shù)中鑒定的這些和額外的轉(zhuǎn)錄因子了802個(gè)TFs進(jìn)行TaqMan實(shí)時(shí)PCR分析。

考慮到植入前發(fā)育表達(dá)譜的復(fù)雜性比默，我們認(rèn)為有必要同時(shí)分析多個(gè)基因幻捏，以根據(jù)調(diào)控基因的表達(dá)來捕獲細(xì)胞身份，而不僅僅是一個(gè)或兩個(gè)命咐。我們使用48.48動(dòng)態(tài)陣列芯片(Fluidigm)篡九，它允許在單細(xì)胞水平上平行定量分析48個(gè)基因。該分析包括人工分離單個(gè)卵裂球/細(xì)胞醋奠，隨后裂解榛臼，cDNA合成，并在單個(gè)管中進(jìn)行序列特異性的前倍化窜司，并使用TaqMan real-time PCR在BioMark系統(tǒng)(Fluidigm)上定量基因表達(dá)沛善。成功的關(guān)鍵是基因的選擇。我們主要關(guān)注初始篩選中包含的轉(zhuǎn)錄因子塞祈，假設(shè)這些轉(zhuǎn)錄因子可能是細(xì)胞命運(yùn)的驅(qū)動(dòng)因素金刁。其余的基因是根據(jù)囊胚內(nèi)已知的差異表達(dá)選擇的，或者是根據(jù)早期發(fā)育中的已知功能選擇的议薪，或者兩者兼有尤蛮。最后的48個(gè)基因(表S2)，包括27個(gè)轉(zhuǎn)錄因子斯议，我們從129個(gè)基因中選擇了它們?cè)谀遗邌渭?xì)胞基因表達(dá)檢測(cè)中的應(yīng)用。

研究人員分析了7個(gè)發(fā)育時(shí)間點(diǎn)(卵母細(xì)胞哼御、2細(xì)胞坯临、4細(xì)胞、8細(xì)胞艇搀、桑椹胚尿扯、E3.5胚泡和E4.25胚泡)以及通過免疫外科分離的E4.25 ICMs的mRNA水平。（500個(gè)細(xì)胞來源）

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[if !supportLists]2.?[endif]囊胚的細(xì)胞數(shù)量更多焰雕，為什么不做發(fā)育到囊胚這個(gè)階段呢衷笋？因?yàn)楣ぷ髁扛髥幔看穑阂驗(yàn)槟遗呤菦Q定細(xì)胞命運(yùn)的決定階段

[if !supportLists]3.?[endif]位置和信號(hào)事件似乎先于轉(zhuǎn)錄程序的成熟矩屁。（郭老師這句話的意思是啥呢辟宗？不是轉(zhuǎn)錄組成熟調(diào)控的嗎，而是取決于細(xì)胞所處的位置嗎吝秕，內(nèi)與外）

答：與位置相關(guān)泊脐，主要見圖四。最初在16細(xì)胞期單細(xì)胞中等量表達(dá)烁峭，但隨后逐漸與內(nèi)部細(xì)胞位置相關(guān)容客，并最終顯示出對(duì)32細(xì)胞ICM的高度特異性秕铛。此外還存在反向表達(dá)。在桑椹胚中缩挑，大多數(shù)基因的位置分配先于差異mRNA水平但两。

背景知識(shí)（Introduction有介紹，上述不少問題就可以回答了）

小鼠植入前發(fā)育為研究細(xì)胞命運(yùn)決定的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了一個(gè)有吸引力的模型供置。這個(gè)發(fā)育期從受精開始谨湘，從1細(xì)胞合子發(fā)展到胚泡。就在著床之前芥丧，胚胎由三種不同的細(xì)胞類型組成紧阔，滋養(yǎng)外胚層、原始內(nèi)胚層和外胚層续担。胚胎上皮是一種功能性上皮擅耽，負(fù)責(zé)介導(dǎo)與子宮壁的附著和植入，隨后對(duì)胎盤做出貢獻(xiàn)赤拒，胚胎上皮是一種胚胎外細(xì)胞類型秫筏，其后代為發(fā)育中的胚胎提供模式線索和營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，多能上皮產(chǎn)生胚胎本身的所有細(xì)胞類型挎挖，是胚胎干細(xì)胞的來源这敬。盡管從經(jīng)典的發(fā)育研究中獲得了許多見解，但對(duì)控制這些第一批細(xì)胞命運(yùn)決定的發(fā)育遺傳調(diào)控結(jié)構(gòu)仍然只有初步的了解蕉朵。盡管轉(zhuǎn)錄的合子激活在1至2細(xì)胞階段的早期就開始了(Schultz捣郊，2002)众羡，但細(xì)胞分化發(fā)生在胚胎壓實(shí)后很晚鹏往。雖然早期的卵裂模式似乎使卵裂球偏向特定的命運(yùn)(Jedrusik等人议双，2008年)，但胚泡的形成本質(zhì)上主要是可調(diào)控的汛闸，所有16細(xì)胞卵裂球都保留了對(duì)三種胚泡細(xì)胞譜系中任何一種作出貢獻(xiàn)的能力(Rossant和Lis蝙茶，1979年；Rossant和Vijh诸老，1980年隆夯；Suwinska等人，2008年别伏；Ziomek等人蹄衷，1982年)，桑椹胚內(nèi)的位置是最終細(xì)胞命運(yùn)決定的最重要貢獻(xiàn)者(所以作者研究了桑葚胚Rossant和Tam厘肮，2009年)愧口。

TE大約在32細(xì)胞階段(e 3.25–e 3.5)首先形成。它來源于桑椹胚外表面細(xì)胞的成熟(Johnson和McConnell类茂，2004)耍属。已知Tead4是TE形成最早需要的轉(zhuǎn)錄因子(TF)托嚣；雖然在植入前胚胎中普遍表達(dá)，但它通過Hippo途徑被功能性激活(西岡等厚骗，2008注益，2009；Yagi等人溯捆，2007年)。位于TEad4下游的Cdx2和Gata3是從8細(xì)胞期到胚泡共表達(dá)的兩種TE特異性轉(zhuǎn)錄因子(Home等人厦瓢，2009提揍；Ralston等人，2010年煮仇；羅爾斯頓和羅桑特劳跃，2008年；Strumpf等人浙垫，2005年)刨仑。它們的表達(dá)最初不局限于外部細(xì)胞，但隨后局限于新生的TE夹姥。雖然這兩者對(duì)于胚胎移植來說都不是必需的杉武，但是兩者都驅(qū)動(dòng)滋養(yǎng)層特異性基因的表達(dá)。

原始內(nèi)胚層和外胚層由內(nèi)部細(xì)胞團(tuán)形成辙售。盡管這兩種譜系的形成機(jī)制尚不清楚(Rossant和Tam轻抱，2009年)，但已經(jīng)表明旦部，這些ICM細(xì)胞的命運(yùn)在很大程度上是在將PE定位在ICM面向胚泡的表面之前決定的(Chazaud等人祈搜，2006年；Gerbe等人士八，2008年容燕；Plusa等人，2008年)婚度，其中最全面的基因表達(dá)分析是通過單細(xì)胞微陣列分析完成的----（注意微陣列做了這個(gè)現(xiàn)象）(Kurimoto等人蘸秘，2006年)。

對(duì)這些ICM命運(yùn)決定的分子控制最了解的是EPI陕见。Oct4秘血、Sox2和Nanog都是已知的對(duì)EPI的形成和/或維持至關(guān)重要的TFs，并且這些TFs中的每一個(gè)的空胚胎都是不能產(chǎn)生胚胎干細(xì)胞的评甜。Oct4和Nanog空囊胚既沒有EPI特征灰粮，也沒有PE特征，只產(chǎn)生滋養(yǎng)層衍生物(Nichols等忍坷，1998粘舟；Silva等人熔脂，2009年)，而在Sox2空胚胎中柑肴，最初認(rèn)為ICM已經(jīng)建立霞揉，但是EPI細(xì)胞沒有得到維持，并且至少部分與PE有關(guān)(Avilion等人晰骑，2003年)适秩。Gata6和Gata4都是PE的早期標(biāo)志(Chazaud等人，2006年硕舆；Kaji等人秽荞，2007年；Plusa等人抚官，2008)扬跋，并且當(dāng)在胚胎干細(xì)胞中過度表達(dá)時(shí)，能夠驅(qū)動(dòng)胚胎干細(xì)胞程序的表達(dá)(藤倉等人凌节，2002)钦听，但是這兩種敲除都不會(huì)導(dǎo)致胚胎干細(xì)胞缺陷。PE缺陷表型在涉及FGF信號(hào)的敲除中很明顯倍奢。Fgf4(配體)朴上、Fgfr2(受體)和Grb2(下游效應(yīng)子)空胚胎缺乏PE和/或其植入后衍生物(Arman等人，1998卒煞；Chazaud等人余指，2006年；費(fèi)爾德曼等人跷坝，1995年)酵镜。這表明FGF信號(hào)在ICM細(xì)胞分化為PE中的重要作用，但尚不清楚這是如何建立的柴钻，因?yàn)闆]有證據(jù)表明這些成分在早期ICM中的差異表達(dá)（因?yàn)榉只昂蟮腇GF信號(hào)不能確定淮韭，所以沒法說明FGF在ICM分化為PE中起作用）。

最近的報(bào)告描述了譜系限制的轉(zhuǎn)錄因子在桑椹胚內(nèi)的單個(gè)卵裂球中的共表達(dá)(Dietrich和Hiiragi贴届，2007靠粪；Plusa等人，2008年毫蚓；Ralston和Rossant占键，2008)強(qiáng)調(diào)了更全面地定義表達(dá)模式的必要性。因此元潘，研究人員試圖在單細(xì)胞水平上分析一組廣泛的調(diào)控因子畔乙，這些調(diào)控因子結(jié)合起來可以更好地定義胚泡發(fā)育過程中的事件。研究人員的重點(diǎn)是捕捉最初的轉(zhuǎn)錄差異翩概，因?yàn)檫@些差異先于對(duì)特定細(xì)胞命運(yùn)的承諾牲距。研究人員平行分析了從1細(xì)胞受精卵到64細(xì)胞胚泡的500多個(gè)單個(gè)細(xì)胞中48個(gè)基因的mRNA水平返咱，從而為發(fā)育中的小鼠胚胎的最早細(xì)胞命運(yùn)決定提供了前所未有的洞察力。

結(jié)果

[if !supportLists]1.?[endif]單細(xì)胞分析候選轉(zhuǎn)錄因子的鑒定

由于TFs對(duì)于確定細(xì)胞類型特異性表型至關(guān)重要牍鞠，研究人員首先建立了一個(gè)高質(zhì)量的數(shù)據(jù)集咖摹，其中包含了這些調(diào)控分子的一整套植入前表達(dá)動(dòng)力學(xué)。研究人員首先在NCBI的UniGene數(shù)據(jù)庫(Wheeler等人难述，2003)中鑒定了來自小鼠植入前胚胎的131萤晴，845個(gè)表達(dá)序列標(biāo)簽中所代表的轉(zhuǎn)錄因子。在小鼠基因組中編碼的2348個(gè)預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄因子中(Panther數(shù)據(jù)庫胁后；www.pantherdb.org)硫眯，885個(gè)(38%)至少有一個(gè)植入前EST，表明了這一短暫發(fā)育時(shí)期的轉(zhuǎn)錄復(fù)雜性择同。根據(jù)從胚胎干細(xì)胞和滋養(yǎng)層干細(xì)胞文庫產(chǎn)生的無害環(huán)境技術(shù)中鑒定的這些和額外的轉(zhuǎn)錄因子，兩種細(xì)胞系來源于胚泡(Evans和Kaufman净宵，1981敲才；Tanaka等人，1998)择葡，我們選擇了802個(gè)TFs進(jìn)行TaqMan實(shí)時(shí)PCR分析(參見在線提供的補(bǔ)充信息)紧武。

我們分析了7個(gè)發(fā)育時(shí)間點(diǎn)(卵母細(xì)胞、2細(xì)胞敏储、4細(xì)胞阻星、8細(xì)胞、桑椹胚已添、E3.5胚泡和E4.25胚泡)以及通過免疫外科分離的E4.25 ICMs的mRNA水平妥箕。這些數(shù)據(jù)(表S1，保藏于www.informatics.jax.org更舞，保藏號(hào)為J:140465)除了提供胚泡內(nèi)的細(xì)胞類型特異性表達(dá)(TE對(duì)EPI/PE)之外畦幢，還提供了通過植入前發(fā)育的全面基因表達(dá)動(dòng)力學(xué)。全囊胚與ICM的比較提供了胚胎移植和上皮內(nèi)瘤變/上皮內(nèi)瘤變表達(dá)的特異性分?jǐn)?shù)缆蝉，已知胚胎移植標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)具有高胚胎移植特異性分?jǐn)?shù)的事實(shí)證實(shí)了這一點(diǎn)(圖S1A)宇葱。盡管這種分析不能區(qū)分ICM內(nèi)的PE和EPI細(xì)胞類型，但我們能夠根據(jù)來自單個(gè)ICM細(xì)胞微陣列實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)刊头，將一些ICM限制性基因指定為可能的EPI或PE標(biāo)記(Kurimoto等人黍瞧，2006)。

有了這些時(shí)間和空間表達(dá)數(shù)據(jù)原杂，我們就可以開始識(shí)別細(xì)胞類型形成的分子動(dòng)力學(xué)印颤，即受精卵在胚泡內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)槿N不同的細(xì)胞類型。從這些TF表達(dá)譜的復(fù)雜性可以明顯看出穿肄，定義細(xì)胞類型的挑戰(zhàn)是通過發(fā)育形成的膀哲。通過追蹤在E4.25胚泡中特異性表達(dá)的多種標(biāo)記往产，對(duì)于三種不同細(xì)胞類型中的任何一種，顯然至少出現(xiàn)了三種不同的發(fā)育表達(dá)模式(圖S1C和S1D)某宪。以TE特異性TFs為例仿村，Tcfap2c水平在整個(gè)胚胎植入前發(fā)育過程中保持不變，Cdx2和Gata3在8細(xì)胞-胚胎轉(zhuǎn)化時(shí)上調(diào)兴喂，Gata2和Tcfap2a在桑椹胚-囊胚轉(zhuǎn)化時(shí)上調(diào)蔼囊。

[if !supportLists]2.?[endif]單細(xì)胞基因表達(dá)分析

我們的初始數(shù)據(jù)擴(kuò)展了囊胚中細(xì)胞類型特異性轉(zhuǎn)錄因子的已知庫，并暗示了導(dǎo)致這種表達(dá)的復(fù)雜轉(zhuǎn)錄動(dòng)力學(xué)衣迷。然而畏鼓，這些數(shù)據(jù)是由細(xì)胞池產(chǎn)生的，由于細(xì)胞命運(yùn)的決定是由單個(gè)細(xì)胞決定的壶谒，這種平均表達(dá)可能掩蓋了有趣的單細(xì)胞動(dòng)態(tài)云矫。因此，我們接下來分析了單細(xì)胞水平的表達(dá)汗菜。考慮到植入前發(fā)育表達(dá)譜的復(fù)雜性让禀，我們認(rèn)為有必要同時(shí)分析多個(gè)基因，以根據(jù)調(diào)控基因的表達(dá)來捕獲細(xì)胞身份陨界，而不僅僅是一個(gè)或兩個(gè)巡揍。我們使用48.48動(dòng)態(tài)陣列芯片(Fluidigm)，它允許在單細(xì)胞水平上平行定量分析48個(gè)基因菌瘪。該分析包括人工分離單個(gè)卵裂球/細(xì)胞腮敌，隨后裂解，cDNA合成俏扩，并在單個(gè)管中進(jìn)行序列特異性的前倍化糜工，并使用TaqMan real-time PCR在BioMark系統(tǒng)(Fluidigm)上定量基因表達(dá)。成功的關(guān)鍵是基因的選擇录淡。我們主要關(guān)注初始篩選中包含的轉(zhuǎn)錄因子啤斗，假設(shè)這些轉(zhuǎn)錄因子可能是細(xì)胞命運(yùn)的驅(qū)動(dòng)因素。其余的基因是根據(jù)囊胚內(nèi)已知的差異表達(dá)選擇的赁咙，或者是根據(jù)早期發(fā)育中的已知功能選擇的钮莲，或者兩者兼有。最后的48個(gè)基因(表S2)彼水，包括27個(gè)轉(zhuǎn)錄因子崔拥，我們從129個(gè)基因中選擇了它們?cè)谀遗邌渭?xì)胞基因表達(dá)檢測(cè)中的應(yīng)用。

使用這48個(gè)基因集凤覆，研究人員初步分析了從受精卵到胚泡不同發(fā)育階段獲得的總共442個(gè)單細(xì)胞(表S3)链瓦。數(shù)據(jù)的生物再現(xiàn)性在64細(xì)胞囊胚清晰顯現(xiàn)，導(dǎo)致大多數(shù)細(xì)胞明確分配到特定的細(xì)胞類型。64細(xì)胞期胚泡的159個(gè)細(xì)胞表達(dá)譜的層次聚類明確揭示了現(xiàn)階段已知存在的三種細(xì)胞類型(圖1A)慈俯。95個(gè)細(xì)胞(60%)富含TE特異性標(biāo)記物渤刃，如Cdx2和Krt8。40個(gè)細(xì)胞(25%)特異性富集PE標(biāo)記Gata4和Pdgfra贴膘，18個(gè)細(xì)胞(11%)特異性富集EPI限制性基因卖子，包括Nanog和Sox2。有趣地刑峡，一小組五個(gè)細(xì)胞洋闽，都來自同一個(gè)胚胎，表達(dá)了EPI和PE的一些標(biāo)記突梦，表明細(xì)胞處于過渡狀態(tài)诫舅。64細(xì)胞的胚胎159個(gè)細(xì)胞中只有一個(gè)看起來確實(shí)異常，沒有與三種細(xì)胞類型中的任何一種緊密對(duì)齊宫患。

為了更好地可視化數(shù)據(jù)刊懈，我們使用了主成分分析。主成分分析在高維空間中獲取數(shù)據(jù)點(diǎn)娃闲，并定義穿過該空間的新軸(分量)虚汛，使得第一個(gè)分量捕獲數(shù)據(jù)中盡可能多的方差，第二個(gè)分量(與第一個(gè)正交)捕獲盡可能多的剩余方差畜吊，等等。這里户矢，數(shù)據(jù)點(diǎn)是細(xì)胞玲献，空間是48維的(48個(gè)基因)，每個(gè)維度的坐標(biāo)是細(xì)胞中給定基因的標(biāo)準(zhǔn)化基因表達(dá)值梯浪。重要的是捌年，因?yàn)榻M件跨越這個(gè)48D空間，每個(gè)組件都有來自所有48個(gè)基因的貢獻(xiàn)挂洛。應(yīng)用于從64細(xì)胞胚胎礼预，我們發(fā)現(xiàn)第一主成分(PC1)解釋了58.6%的觀察方差，而第二主成分(PC2)解釋了13.5%虏劲。細(xì)胞表達(dá)模式在pc1和pc2上的投影清楚地將單個(gè)細(xì)胞分成三個(gè)不同的簇(圖1B)托酸。TE簇(例如以Cdx2表達(dá)為特征)可以沿著PC1軸與ICM細(xì)胞區(qū)分開，而兩種不同類型的ICM細(xì)胞(EPI柒巫，以Nanog為特征励堡，PE，以Gata4為特征)可以沿著PC2軸彼此區(qū)分開堡掏。注意应结，細(xì)胞不是根據(jù)它們?cè)诮馄逝咛ブ械奈恢脕碜R(shí)別的，而是根據(jù)它們表達(dá)模式的關(guān)鍵特征來定義的。

由于PCA成分由所有48個(gè)基因組成鹅龄，因此在64細(xì)胞階段對(duì)三種細(xì)胞類型進(jìn)行分類時(shí)揩慕，有可能識(shí)別出信息最豐富的基因(圖1C)。雖然技術(shù)因素可能掩蓋了Cdx2和Gata3特異性的程度(見補(bǔ)充信息)扮休，但I(xiàn)d2迎卤、Dppa1、Tspan8和Krt8是TE最特異的標(biāo)志物肛炮。EPI是Fgf4, Bmp4, Sox2, Nanog止吐，和Klf2, PE, Gata4, Pdgfra，和Creb3l2侨糟。其他基因具有兩種細(xì)胞類型的特征碍扔，但在第三種細(xì)胞中缺失或表達(dá)不良。例如秕重，原型多能TF Pou5f1/ Oct4雖然在ICM中富集不同，但在這個(gè)階段并不能區(qū)分EPI和PE譜系，因?yàn)樗谶@些細(xì)胞類型中同樣表達(dá)溶耘。同樣二拐，基因如Gata6、Fgfr2和Dab2在EPI系中不表達(dá)凳兵，但在TE和PE系中均有高表達(dá)百新。這些表達(dá)模式反映在這些基因在PCA投影中的中間位置(圖1C)

[if !supportLists]3.?[endif]單個(gè)16細(xì)胞卵裂球的混合譜系表達(dá)

細(xì)胞分化被認(rèn)為是在8細(xì)胞后期發(fā)生壓實(shí)和極化事件后開始的(Johnson和McConnell，2004)庐扫。與這一想法一致饭望，我們?cè)?、4或8細(xì)胞階段的單個(gè)細(xì)胞中沒有發(fā)現(xiàn)明顯的特征(圖S2)形庭。為了可視化隨后發(fā)生的變化铅辞，我們投射了細(xì)胞的表達(dá)模式從未壓縮的8細(xì)胞階段到到32細(xì)胞階段計(jì)算出64細(xì)胞階段數(shù)據(jù)(圖2A)。在這個(gè)發(fā)育時(shí)間框架中捕獲的三個(gè)卵裂分裂中的每一個(gè)的轉(zhuǎn)變有助于三種不同細(xì)胞類型向64細(xì)胞階段PC坐標(biāo)的進(jìn)展萨醒。在8-至16-細(xì)胞的轉(zhuǎn)變中斟珊，細(xì)胞作為一個(gè)群體，向TE譜系靠攏富纸。到32細(xì)胞期囤踩，大多數(shù)細(xì)胞要么是TE樣的，要么類似于ICM細(xì)胞類型之一晓褪，但I(xiàn)CM中的細(xì)胞身份尚未完全確定高职。到64細(xì)胞階段，基本上所有細(xì)胞都被很好地分解成三種細(xì)胞類型之一辞州。

如前所述怔锌，在64細(xì)胞胚胎的特征是三種細(xì)胞類型的TFs高表達(dá)。有趣的是，許多隨后在胚泡中成為細(xì)胞類型受限的轉(zhuǎn)錄因子在大多數(shù)單個(gè)16細(xì)胞卵裂球中高水平共表達(dá)埃元，并且表達(dá)水平與后來在譜系受限的64細(xì)胞階段單個(gè)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的相當(dāng)涝涤。圖示為TE (Cdx2，Gata3)岛杀、EPI (Nanog阔拳，Klf2)、EPI和PE (Pou5f1)以及PE (Gata6)的代表性標(biāo)記(圖2B)类嗤，但這也見于隨后譜系受限的其他TFs糊肠，包括Esrrb、Klf4遗锣、Runx1货裹、Snai1和Grhl2(圖S4)。最近描述Nanog與Cdx2和Gata6共定位的報(bào)告與我們的數(shù)據(jù)一致(Dietrich和Hiiragi精偿，2007弧圆；Plusa等人，2008年)笔咽。母體轉(zhuǎn)錄物不能解釋16細(xì)胞卵裂球中的高mRNA轉(zhuǎn)錄物水平搔预，因?yàn)樵?6細(xì)胞階段之前轉(zhuǎn)錄的大量合子激活是明顯的(圖S4)。因此叶组，對(duì)于這些轉(zhuǎn)錄因子中的許多來說拯田，在從桑椹胚到胚泡的轉(zhuǎn)變過程中，細(xì)胞類型形成時(shí)甩十，其競(jìng)爭(zhēng)譜系中的mRNAs被去除船庇，而不是其各自譜系中的增加。

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[if !supportLists]4.?[endif]內(nèi)部和外部細(xì)胞的早期差異

我們下一步的目標(biāo)是確定桑椹胚向囊胚轉(zhuǎn)變中最早的顯著表達(dá)差異枣氧，也許是為了對(duì)相應(yīng)的細(xì)胞命運(yùn)決定獲得一些機(jī)械性的見解溢十。我們從進(jìn)一步分析16細(xì)胞和32細(xì)胞胚胎的單細(xì)胞產(chǎn)生的數(shù)據(jù)開始垮刹。來自該模式的細(xì)胞被分類為干細(xì)胞达吞，并測(cè)定了從16細(xì)胞胚胎到這些細(xì)胞類型的基因表達(dá)變化。在TFs中荒典，Id2和Sox2因其在16-細(xì)胞至32-細(xì)胞階段異常強(qiáng)的誘導(dǎo)作用而引人注目酪劫，Id2的誘導(dǎo)可能發(fā)生在新生的TE細(xì)胞中，Sox2發(fā)生在新生的ICM細(xì)胞中(圖3A)寺董。同樣覆糟，這與其他許多TFs形成對(duì)比，如Nanog和Pou5f1遮咖，其水平在單細(xì)胞水平上從16細(xì)胞卵裂球到32細(xì)胞ICM幾乎保持不變(盡管很高)滩字。接下來，研究人員在16細(xì)胞桑椹胚的不同細(xì)胞中尋找Id2和Sox2更早上調(diào)的證據(jù)，第一階段有內(nèi)外細(xì)胞麦箍。雖然我們?cè)谶@個(gè)階段沒有解析TE和ICM細(xì)胞類型漓藕，但是沿著PC1軸有一些細(xì)胞分散，提示一些差異表達(dá)(圖2A)挟裂。根據(jù)PC1評(píng)分對(duì)16個(gè)細(xì)胞階段的細(xì)胞進(jìn)行排序顯示出Id2/Sox2的反向相關(guān)性享钞，在PC1軸的ICM端的細(xì)胞中Sox2最高，在TE端的細(xì)胞中Id2最高(圖3B)诀蓉。相比之下栗竖，在桑椹胚細(xì)胞群體中，TE特異性標(biāo)記Cdx2和Gata3的變異似乎不如Id2顯著渠啤。

為了解決這些基因表達(dá)差異是不同細(xì)胞群體之間差異的結(jié)果狐肢，還是僅僅是隨機(jī)噪音的結(jié)果，我們用小提琴圖分析了我們的數(shù)據(jù)(圖3C)埃篓。在這些密度圖中处坪，群體噪聲和基因表達(dá)噪聲應(yīng)在參考水平附近呈現(xiàn)單峰分布，而多峰分布表明了細(xì)胞群體之間明顯的基因表達(dá)差異架专。正如所預(yù)期的同窘，內(nèi)源性對(duì)照Actb表達(dá)水平的分布是單峰的，非常窄的峰表明單個(gè)細(xì)胞之間的低差異部脚。盡管大多數(shù)基因在16細(xì)胞階段保持這種單峰分布想邦，但Sox2和Id2都清楚地顯示了這一點(diǎn)雙峰分布。因此委刘，結(jié)合Id2/Sox2的反向相關(guān)性丧没，在桑椹胚中似乎存在Id2高/Sox2低-和Id2低/Sox 2高-表達(dá)細(xì)胞的不同群體

為了確定id2 high/sox2low和id2 low/sox2high細(xì)胞群是否與桑椹胚內(nèi)的位置相關(guān)，我們接下來在解離和單細(xì)胞表達(dá)分析之前用普通細(xì)胞膜標(biāo)記熒光染料(PKH26)標(biāo)記完整胚胎（標(biāo)記位置這一招厲害了锡移，探究位置是否也類似空間呢）呕童。這允許基于增加的熒光對(duì)外部細(xì)胞進(jìn)行特定標(biāo)記。此外淆珊，我們旨在捕獲從16細(xì)胞階段過渡到32細(xì)胞階段的胚胎夺饲，并在此時(shí)間范圍內(nèi)收獲胚胎。用48基因組分析從16細(xì)胞施符、24細(xì)胞往声、32細(xì)胞胚胎總共收獲的132個(gè)細(xì)胞，并分類為高熒光(外細(xì)胞)或低熒光(內(nèi)細(xì)胞)戳吝，排除中間熒光細(xì)胞浩销。該分析不僅證實(shí)了確實(shí)反向的Id2/Sox2表達(dá)是最早可識(shí)別的表達(dá)差異，而且表明Id2low/Sox2high細(xì)胞代表桑椹胚的內(nèi)部細(xì)胞(圖4A听哭；主成分預(yù)測(cè)見圖S3)慢洋。值得注意的是塘雳，ICM標(biāo)記物如Nanog、Esrrb和Klf2最初在16細(xì)胞期單細(xì)胞中等量表達(dá)普筹，但隨后逐漸與內(nèi)部細(xì)胞位置相關(guān)粉捻，并最終顯示出對(duì)32細(xì)胞ICM的高度特異性(圖4A)。這一結(jié)果表明斑芜，在桑椹胚中肩刃，大多數(shù)基因的位置分配先于差異mRNA水平。

為了提供內(nèi)部細(xì)胞特異性上調(diào)Sox2表達(dá)的獨(dú)立確認(rèn)杏头，我們接下來分析了含有靶向Sox2位點(diǎn)的EGFP報(bào)告子的小鼠(Ellis等人盈包，2004)。為了避免與卵母細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的EGFP分析混淆醇王，由于在卵母細(xì)胞中檢測(cè)到Sox2轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì)呢燥，我們通過將雜合雄性與野生型雌鼠交配來追蹤父系EGFP等位基因的表達(dá)（報(bào)告基因小鼠與避免混合示蹤）。因此寓娩，產(chǎn)生的胚胎要么是野生型的叛氨，要么是雜合的，其中EGFP表達(dá)來自父系等位基因棘伴。在8細(xì)胞階段寞埠，沒有胚胎表達(dá)EGFP。EGFP表達(dá)首先在大約50%的胚胎(預(yù)期部分)中在晚期桑椹胚的內(nèi)細(xì)胞中被檢測(cè)到焊夸，并且這種表達(dá)隨后被限制在早期胚泡的ICMs中(圖4B)仁连，因此至少從內(nèi)部等位基因獨(dú)立地證實(shí)了在我們的單細(xì)胞分析中檢測(cè)到的Sox2 mRNA水平的內(nèi)細(xì)胞特異性增加。由于Sox2是多能性調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子之一阱穗，這從Sox2空胚胎中EPI缺乏維持(Avilion等人饭冬，2003年)及其在誘導(dǎo)分化細(xì)胞重編程為多能狀態(tài)(即iPS細(xì)胞)中的效用得到證明(Takahashi和Yamanaka，2006年)揪阶，我們發(fā)現(xiàn)其內(nèi)部細(xì)胞特異性上調(diào)對(duì)于內(nèi)源性多能性調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的建立非常重要昌抠。這種表達(dá)與其他多能性和重編程因子形成鮮明對(duì)比。Oct4 (Pou5f1)鲁僚、Nanog炊苫、Esrrb和Klf4在8細(xì)胞和16細(xì)胞胚胎的幾乎所有卵裂球中都大量表達(dá)(圖4C)。這些轉(zhuǎn)錄因子對(duì)外胚層細(xì)胞的限制是由于下調(diào)其他兩個(gè)胚泡譜系內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平蕴茴，而不是內(nèi)部細(xì)胞/EPI特異性轉(zhuǎn)錄增加引起的劝评。相比之下姐直，在8細(xì)胞階段倦淀，Sox2基因處于最低水平(從母體轉(zhuǎn)錄物的高水平下降)，然后在16細(xì)胞胚胎的內(nèi)細(xì)胞中增加声畏。因此撞叽，在從受精卵到多能基態(tài)的過程中(Nichols和Smith姻成，2009)，Sox2是最后一個(gè)被轉(zhuǎn)錄激活的重編程因子愿棋，但也是第一個(gè)標(biāo)記發(fā)育胚胎中細(xì)胞群體差異的因子科展。

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[if !supportLists]5.?[endif]從內(nèi)細(xì)胞到EPI和PE

ICM形成了EPI和PE。要深入了解EPI / PE隔離機(jī)制糠雨，我們返回了我們的SingleCell數(shù)據(jù)才睹，以確定ICM內(nèi)最早的表達(dá)差異。這些差異在沿PC1（圖2a）分類為ICM的細(xì)胞中甘邀，在從32細(xì)胞到64-細(xì)胞胚泡中的過渡中沿PC1（圖2a）琅攘。因此，我們計(jì)算了使用50個(gè)ICM細(xì)胞在32細(xì)胞數(shù)據(jù)集中的50個(gè)ICM細(xì)胞的1035對(duì)基因（不包括用于歸一化的ACTB和GAPDH）的基因表達(dá)的相關(guān)性松邪，并且分別是55個(gè)ICM細(xì)胞在64細(xì)胞數(shù)據(jù)集中坞琴。與E3.5 ICM內(nèi)的Nanog和GATA4 / 6一致（Chazaud等，2006; Plusa等逗抑，2008）剧辐，我們發(fā)現(xiàn)Nanog/ GATA4基因?qū)蚇anog/ GATA6基因?qū)?b>在64個(gè)細(xì)胞ICM細(xì)胞中表達(dá)水平與32細(xì)胞ICM細(xì)胞中的微不足道或弱相關(guān)性相關(guān)（圖5A）。

實(shí)際上邮府，幾乎所有32個(gè)ICM細(xì)胞含有高mRNA水平的Nanog和GATA6荧关，而GATA4最初是低的。通過在從32細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)?4細(xì)胞階段的ICM細(xì)胞的亞群中強(qiáng)烈激活表達(dá)的來實(shí)現(xiàn)GATA4的后期PE特異性褂傀，以從32細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)?4細(xì)胞階段（圖5C和5D）羞酗。Nanog和GATA6的EPI和PE特異性分別是在轉(zhuǎn)換到64個(gè)單元階段的相對(duì)細(xì)胞類型中下調(diào)的結(jié)果（圖5C和5D）。有趣的是紊服，早期ICM（32細(xì)胞）細(xì)胞之間具有最強(qiáng)逆相關(guān)性的基因?qū)Σ⒉簧婕癟FS檀轨，而是編碼配體/受體對(duì)FGF4 / FGFR2（圖5A），這考慮到它們的必要性非常重要在原胚層形成中的作用（Arman等欺嗤，1998; Feldman等参萄，1995）。據(jù)我們所知煎饼，這是第一種證據(jù)表明這些基因在早期的ICM內(nèi)讹挎。顯然通過FGFR 2的減少（在16細(xì)胞階段高度表達(dá)）和32細(xì)胞ICM細(xì)胞亞群中的FGF4（在16細(xì)胞階段的低）增加（圖5B-5D）中的FGF4（低于16細(xì)胞階段的低溫）的逆相關(guān)性（圖5B-5D） 。在64個(gè)單元ICM內(nèi)吆玖，F(xiàn)GF4僅限于EPI和FGFR2至PE（圖5B-5D）筒溃。

為了在ICM發(fā)育監(jiān)管網(wǎng)絡(luò)的背景下定位FGF信號(hào)，我們特異性FGFR抑制劑SU5402桑葚胚（E3.0）期間到胚泡（E4.0）的胚胎與沾乘，一種提高ES細(xì)胞衍生效率的治療方法（ying等怜奖，2008）。我們用我們的曲線標(biāo)記分析了個(gè)體胚泡翅阵，雖然沒有作為單細(xì)胞分析的全面洞察歪玲，但我們可以根據(jù)我們的野生型單細(xì)胞數(shù)據(jù)推斷出譜系特定的轉(zhuǎn)錄組變化迁央。值得注意的是，與載體對(duì)照相比滥崩，所有抑制胚胚狀物表明大多數(shù)PE特異性發(fā)育調(diào)節(jié)劑的表達(dá)（例如GATA4岖圈，SOX17）顯著降低。這與EPI特異性標(biāo)記相反（例如钙皮，納米和ESRRB）蜂科，其中許多呈現(xiàn)出2至4倍上調(diào)（圖6A）。特異性基因如CDX2短条，GATA3和KRT8不受FGF信號(hào)抑制的影響崇摄。有趣的是，PE標(biāo)記GATA6的水平仍然沒有妨礙慌烧，表明該P(yáng)E特異性標(biāo)記的表達(dá)與FGF信令無關(guān)逐抑。FGATA6發(fā)育過程的表達(dá)水平表明其升高的表達(dá)在FGF4 / FGFR2逆相關(guān)性之前（圖6B）。這與Plusa等人的研究結(jié)果一致屹蚊。 （2008）厕氨。該GATA6表達(dá)式與GATA4（圖6B）和其他PE標(biāo)記（圖S4）相反，其中在建立FGF4 / FGFR2逆相關(guān)之后發(fā)生體積特異性上調(diào)汹粤。通過FGF抑制的PE形成由最近的另一個(gè)研究支持（Nichols等命斧，2009）。我們的數(shù)據(jù)指明FGF信號(hào)上調(diào)PE特異性的TFS GATA4嘱兼，SOX17和CREB3L2的轉(zhuǎn)錄上游国葬。

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