【引言】 單細(xì)胞測序技術(shù)是21世紀(jì)生命科學(xué)領(lǐng)域的前沿技術(shù)，自誕生之日起就給科學(xué)的發(fā)展提供了很多新的發(fā)現(xiàn)蚓曼，更是連續(xù)數(shù)年被Nature等頂級期刊評為“年度技術(shù)”广料。作為單細(xì)胞領(lǐng)域的技術(shù)從業(yè)者专甩，

一、單細(xì)胞測序技術(shù)為什么如此火熱

??細(xì)胞是生物體和生物過程的運(yùn)作基礎(chǔ)辆憔，在類型、行為和狀態(tài)上有著廣泛的差異（即細(xì)胞異質(zhì)性）报嵌。傳統(tǒng)的基因測序方法（Bulk RNA-seq）是對組織進(jìn)行的檢測虱咧，得到的結(jié)果是所有細(xì)胞的平均值，會忽略細(xì)胞之間的差異性锚国，比如有的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平比較高腕巡，有的細(xì)胞則比較低。同時如果目標(biāo)細(xì)胞占比本來稀少血筑，則這些細(xì)胞的信息會被平均或覆蓋掉绘沉。

??單細(xì)胞測序技術(shù)很好的解決了bulk RNA-seq的問題，可以對單個細(xì)胞內(nèi)的核酸（DNA或者RNA）進(jìn)行捕獲建庫豺总，因而獲得單個細(xì)胞中的信息车伞。單細(xì)胞分析（scRNA-seq）可以反映群體內(nèi)細(xì)胞間的異質(zhì)性和小群體細(xì)胞的重要功能，特別是細(xì)胞之間的細(xì)微差異也可以解析出喻喳。因此單細(xì)胞測序技術(shù)又被稱為“分子顯微鏡”另玖。

Bulk-seq與scRNA-seq的對比

??單細(xì)胞測序技術(shù)最早興起于2009年，由北京大學(xué)湯富酬教授提出并發(fā)表了第一篇單細(xì)胞文章表伦。隨后十幾年以來持續(xù)不斷地發(fā)展谦去，尤其是近幾年，單細(xì)胞測序出現(xiàn)了爆發(fā)式的發(fā)展和普及蹦哼。2011年鳄哭，《Nature Methods》雜志將單細(xì)胞研究方法列為未來幾年最值得關(guān)注的技術(shù)領(lǐng)域之一。2013年纲熏，《Science》雜志將單細(xì)胞測序列為年度最值得關(guān)注的六大領(lǐng)域榜首妆丘，《Nature Methods》雜志將單細(xì)胞測序的應(yīng)用列為2013年年度最重要的方法學(xué)進(jìn)展锄俄。2017年10月16日，與 “人類基因組計(jì)劃” 相媲美的 “人類細(xì)胞圖譜計(jì)劃” 首批擬資助的38個項(xiàng)目正式公布飘痛，引爆單細(xì)胞測序新時代珊膜。

單細(xì)胞測序技術(shù)的發(fā)展節(jié)點(diǎn)

二、單細(xì)胞測序技術(shù)原理

??目前有兩種方式可以實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞測序宣脉。一種是通過顯微方式直接獲得單個細(xì)胞车柠，并將其內(nèi)部的核酸物質(zhì)獲取出來進(jìn)行文庫構(gòu)建。代表性的技術(shù)有smart-seq2塑猖，采用流式方法進(jìn)行單細(xì)胞的分離獲取竹祷。不過將單細(xì)胞挨個分離出來再分別建庫測序，通量非常低羊苟，這主要受成本的限制塑陵。隨著待測單細(xì)胞的個數(shù)的增長，測序的成本也會幾乎呈線性提升蜡励。

??另一種方式是引入分子標(biāo)簽（barcode）技術(shù)令花，在單細(xì)胞分離的同時給每個細(xì)胞加上獨(dú)一無二的DNA序列，這樣在測序后分析的時候就把攜帶相同barcode的序列視為來自同一個細(xì)胞了凉倚。通過一次建庫可以測得數(shù)百上千個單細(xì)胞的信息兼都。此外，mRNA種類的含量在很大范圍內(nèi)變化稽寒，擴(kuò)增可能會引入額外的偏差扮碧，阻礙mRNA拷貝的精確計(jì)數(shù)，因此又引入了獨(dú)特分子標(biāo)識符（unique molecular identifiers杏糙，UMI）隨機(jī)序列慎王，在擴(kuò)增前作為獨(dú)特標(biāo)簽標(biāo)記不同的mRNA分子，允許區(qū)分原始分子和擴(kuò)增重復(fù)序列宏侍。

分子標(biāo)簽磁珠技術(shù)

??目前針對單細(xì)胞建庫測序的步驟是基本統(tǒng)一的赖淤。scRNA-seq實(shí)驗(yàn)主要涉及以下幾個模塊化步驟：單細(xì)胞懸浮液制備、單細(xì)胞分離和裂解谅河、mRNA提取漫蛔、mRNA逆轉(zhuǎn)錄（RT）到cDNA、測序文庫構(gòu)建旧蛾，以及使用計(jì)算工具進(jìn)行數(shù)據(jù)分析莽龟。

scRNA-seq實(shí)驗(yàn)的模塊化步驟

??隨著單細(xì)胞技術(shù)相關(guān)研究的深入，scRNA-seq的應(yīng)用已從基礎(chǔ)研究擴(kuò)展到臨床研究锨天，如構(gòu)建生物體基因表達(dá)圖譜毯盈、重建細(xì)胞發(fā)育譜系、發(fā)現(xiàn)疾病生物標(biāo)志物病袄、腫瘤免疫微環(huán)境分析和臨床診斷等領(lǐng)域搂赋。

單細(xì)胞測序技術(shù)路線及其應(yīng)用

三赘阀、單細(xì)胞測序技術(shù)的技術(shù)挑戰(zhàn)

??1）準(zhǔn)確、快速地分離單個細(xì)胞脑奠；2） 從單個細(xì)胞中擴(kuò)增微量RNA基公；3）提高大規(guī)模并行處理的細(xì)胞吞吐量，同時降低單獨(dú)文庫準(zhǔn)備和測序的預(yù)算宋欺。4）scRNA-seq方法僅限于多聚腺苷酸mRNA分析轰豆，而非多聚腺苷酸RNA物種，包括非編碼RNA和RNA修飾齿诞，目前的scRNA-seq方法尚未進(jìn)行探索酸休。5）缺少實(shí)驗(yàn)和計(jì)算方法的質(zhì)量控制和標(biāo)準(zhǔn)化的共同基準(zhǔn)。6）空間轉(zhuǎn)錄組的分辨率仍未實(shí)現(xiàn)真正單細(xì)胞水平祷杈。

單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)的常規(guī)分析流程

注：在典型的scRNA-seq工作流程中斑司，細(xì)胞與組織分離，不可避免地丟失有關(guān)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄物如何在組織間或亞細(xì)胞水平上分布的信息但汞。從空間維度探索基因表達(dá) 精確定位轉(zhuǎn)錄物在其原生微環(huán)境中的定位宿刮，保留細(xì)胞間最初的空間轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性。最近私蕾，許多能夠進(jìn)行空間分辨轉(zhuǎn)錄組分析的方法被開發(fā)出來僵缺，它們在解剖學(xué)水平上揭示了區(qū)域特異性轉(zhuǎn)錄模式，例如正常組織和疾病組織之間的細(xì)胞組織差異是目。此外，還可以通過空間轉(zhuǎn)錄組分析來探測亞細(xì)胞水平上的轉(zhuǎn)錄分布差異和空間組織的分子過程标捺。

四懊纳、參考文獻(xiàn)

1、Tang Fuchou, Barbacioru C, Wang Y, et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6(5):377-82(2009)

2亡容、Tang, X., Huang, Y., Lei, J. et al. The single-cell sequencing: new developments and medical applications. Cell Biosci 9, 53 (2019)

3嗤疯、Li H. Single-cell RNA sequencing in Drosophila: Technologies and applications. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2021

4、Chen Y, Song J, Yang C, et al. Single-Cell Sequencing Methodologies: From Transcriptome to Multi-Dimensional Measurement. Small Methods. 2021