DNA甲基化研究案例(一)

本期解讀文獻內(nèi)容“MicroRNA-137的表觀遺傳沉默增加ASCT2的表達和腫瘤谷氨酰胺的代謝.

一、調(diào)控通路

DNA甲基化原理圖

當DNMT(甲基轉(zhuǎn)移酶)抑制劑消耗完時,DNMT結合到靶標基因miR-137的啟動子上對啟動子DNA進行甲基化修飾從而抑制miR-137表達酥泞;當DNMT抑制劑存在時吵血,DNMT不能結合到靶標基因miR-137的啟動子上從而使miR-137順利表達尖殃,而miR-137會結合到ASCT2 Mrna的3’-UTR抑制其翻譯為蛋白質(zhì)以故;ASCT2是谷氨酰胺代謝過程的關鍵酶,ASCT2的表達促進谷氨酰胺的代謝护锤。

二官地、實驗流程

實驗步驟

本文中作者分為兩個部分進行闡述:miR-137作用于ASCT2 mRNA的3’-UTR抑制ASCT的表達,從而使谷氨酸代謝減弱烙懦;甲基化酶結合到miR-137啟動子上促進DNA甲基化抑制miR-137的表達驱入。

(1)作者首先通過三種方法預測以ASCT2為靶標的microRNA,建立miR-137和miR-122過表達細胞株檢測ASCT的表達表明miR-137和miR-122過表達使ASCT2表達降低氯析,然后用WB檢測其他microRNA過表達后的ASCT2的表達表明處理miR-137和miR-122外其他microRNA均不影響ASCT表達亏较,于是作者又通過對不同細胞系進行miR-137過表達后檢測ASCT2的表達進一步驗證miR-137對ASCT2表達的抑制;為了驗證miR-137對ASCT2的抑制機制掩缓,作者通過3’-UTR熒光素酶實驗驗證miR-137與ASCT2 3’-UTR結合從而抑制蛋白表達雪情;作者通過對ASCT2敲低、miR-137敲低和抑制后細胞谷氨酰胺代謝的檢測驗證miR-7通過抑制ASCT表達來抑制谷氨酰胺的代謝你辣。

(2)作者用ChIP實驗技術驗證了甲基轉(zhuǎn)移酶MECP2旺罢、DNMT1和DNMT3B與miR-137啟動子上的CpG島結合使其甲基化抑制miR-137的表達,然后檢測MeCP2敲低或5-Aza-CdR處理后的細胞的miR-137的表達和谷氨酰胺的代謝绢记。

三、核心FIGURE

figure a-c
figure d-f
figure g
figure h
figure i

Figure1說明的是miR-137作用于ASCT2 Mrna的3’-UTR抑制ASCT2的表達正卧,降低谷氨酸代謝蠢熄。

a、 不同方法預測以ASCT2作為靶標的microRNA炉旷。

b签孔、 對miR-137叉讥、miR-122過表達后細胞檢測ASCT2的表達,表明miR-137和miR-122過表達使ASCT2的表達降低饥追。

c图仓、 對一系列的microRNA過表達,然后用WB檢測ASCT2的表達但绕,表明只有MiR-137和miR-122過表達后使ASCT2表達下降救崔。

d、 MiR-137與ASCT2 Mrna 3’-UTR結合位點預測捏顺。

e-f六孵、分別用Q-PCR和WB檢測不同細胞系miR-137過表達后ASCT2的表達,表明miR-137過表達使細胞的ASCT2表達降低

g幅骄、熒光素酶實驗劫窒,檢測miR-137與ASCT2 3’-URT的關系。

h拆座、ASCT2敲低或miR-137過表達后檢測谷氨酰胺的消耗主巍。

i、對miR-137抑制后檢測谷氨酰胺的代謝活性挪凑,表明miR-137抑制后孕索,谷氨酰胺代謝增強。

figure a-e
figure f-g

Figure2說明的是甲基化酶MeCP2岖赋、DNMT1檬果、DNMT3B結合到miR-137啟動子CpG島使DNA甲基化,抑制miR-137的表達唐断,從而降低谷氨酸代謝选脊。

a、 CHIP實驗脸甘,分別用MeCP2恳啥、DNMT1和DNMT3B抗體釣取細胞中與蛋白結合的DNA片段,然后進行q-pcr驗證丹诀,表明這幾種蛋白結合到miR-137啟動子的CpG島钝的。

b、 對MeCP2敲低后檢測miR-137表達铆遭,表明MeCP2抑制miR-137的表達硝桩。

c、 對MeCP2敲低后檢測ASCT2的表達枚荣,表明MeCP2促進ASCT2的表達碗脊。

d-e、用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-CdR處理細胞后檢測miR-137和ASCT2的表達橄妆,表明5-Aza-CdR使miR-137表達升高而使ASCT2表達降低衙伶。

f-g祈坠、MeCP2敲低或用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-CdR處理細胞后檢測谷氨酰胺代謝,表明MeCP2降低后谷氨酰胺代謝降低矢劲。

參考文獻:J Dong,D Xiao,Z Zhao,et al.Epigenetic silencing of microRNA-137 enhances ASCT2 expression and tumor glutamine metabolism. Oncogenesis,2017,6,e356

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