A molecular single-cell lung atlas of lethal COVID-19.
影響因子： 42.778
PMID：33915568
期刊年卷：Nature 2021 Apr 29;
綜合性期刊一區(qū) 綜合性期刊 Q1 1/64
DOI：10.1038/s41586-021-03569-1
https://www.nature.com/articles/s41586-021-03569-1#Abs1
摘要
呼吸衰竭是嚴(yán)重 SARS-CoV-2 感染患者死亡的主要原因，但對肺組織水平的宿主反應(yīng)知之甚少。在這里，我們對 19 名死于 COVID-19 并接受快速尸檢的個(gè)體和 7 名對照個(gè)體的肺中的約 116,000 個(gè)核進(jìn)行了單核 RNA 測序降传。綜合分析確定了細(xì)胞組成酱吝、轉(zhuǎn)錄細(xì)胞狀態(tài)和細(xì)胞間相互作用的重大變化弥喉，從而提供了對致命 COVID-19 生物學(xué)的深入了解您机。COVID-19 患者的肺部高度發(fā)炎，異程显希活化的單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞密集浸潤，但 T 細(xì)胞反應(yīng)受損掌实。與其他病毒和細(xì)菌引起的肺炎相比陪蜻，單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞來源的白細(xì)胞介素-1β 和上皮細(xì)胞來源的白細(xì)胞介素-6 是 SARS-CoV-2 感染的獨(dú)特特征。肺泡 2 型細(xì)胞采用炎癥相關(guān)的瞬時(shí)祖細(xì)胞狀態(tài)贱鼻，未能完全轉(zhuǎn)變?yōu)榉闻?1 型細(xì)胞宴卖，導(dǎo)致肺再生受損。此外邻悬，我們確定了最近描述的擴(kuò)展CTHRC1+病理性成纖維細(xì)胞導(dǎo)致 COVID-19 中迅速發(fā)生的肺纖維化症昏。蛋白質(zhì)活性和配體-受體相互作用的推斷確定了破壞有害回路的假定藥物靶標(biāo)。該圖譜可以解析致命的 COVID-19父丰，可能有助于我們了解 COVID-19 幸存者的長期并發(fā)癥肝谭，并為治療開發(fā)提供重要資源。
引言
在全球范圍內(nèi)础米，由 SARS-CoV-2 感染引起的 COVID-19 大流行已導(dǎo)致超過 1.45 億病例（美國為 3200 萬）和 310 萬例死亡（美國為 570,000分苇；截至 4 月 26 日的數(shù)據(jù)，2021) 1 . 大約 15% 的感染者會發(fā)展為嚴(yán)重疾病屁桑，這可能表現(xiàn)為急性呼吸窘迫綜合征 (ARDS)医寿，并與大量發(fā)病率和死亡率相關(guān)2 , 4。
以前蘑斧，單細(xì)胞RNA測序（scRNA-SEQ）健康個(gè)體的分析已經(jīng)揭示所必需的SARS-CoV的-2條目宿主受體的組織分布5靖秩，6须眷，7，和從患者的支氣管肺泡灌洗液和血液檢查不同嚴(yán)重程度的 COVID-19 已經(jīng)確定了 SARS-CoV-2 感染對免疫反應(yīng)和細(xì)胞因子失調(diào)的影響8 , 9 , 10 , 11 , 12. 然而沟突，由于獲取患者組織的實(shí)際限制花颗，SARS-CoV-2在肺組織水平的影響尚不清楚。一系列尸檢研究檢查了死于 COVID-19 的個(gè)體的福爾馬林固定石蠟包埋 (FFPE) 組織切片惠拭，擴(kuò)展了我們對病毒器官性的理解扩劝，但這些研究在發(fā)現(xiàn)潛力方面受到低重分析（例如例如，免疫組織化學(xué)）和/或延長的驗(yàn)尸間隔（的PMI）职辅，該RNA的質(zhì)量產(chǎn)生不利的影響13棒呛，14，15域携。
我們建立了快速尸檢計(jì)劃簇秒，并根據(jù)機(jī)構(gòu)審查委員會批準(zhǔn)的協(xié)議，在死亡數(shù)小時(shí)內(nèi)從 COVID-19 患者身上收集速凍器官標(biāo)本秀鞭。我們對死于 COVID-19 的個(gè)體和對照個(gè)體的肺樣本進(jìn)行了單核 RNA-seq (snRNA-seq)趋观，以構(gòu)建一個(gè)圖譜，可以深入了解 COVID-19 的病理生理學(xué)锋边，并為進(jìn)一步研究提供關(guān)鍵資源皱坛。
COVID-19 中的肺細(xì)胞景觀
COVID-19 隊(duì)列由 19 名患者（12 名男性和 7 名女性）組成，他們的中位年齡為 72 歲（范圍宠默，58 歲至超過 89 歲）（補(bǔ)充表1麸恍，擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1a），并接受了快速尸檢搀矫。中位數(shù)尸檢間隔 (PMI) 為 4 小時(shí)（范圍抹沪，2-9 小時(shí)）。所有患者都存在與嚴(yán)重 COVID-19 16風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)的潛在合并癥（補(bǔ)充表1）瓤球。對照組包括 7 名個(gè)體（4 男 3 女）融欧，中位年齡為 70 歲（范圍，67 至 79 歲）卦羡，他們在 COVID-19 之前的時(shí)代接受了肺切除術(shù)或活檢（補(bǔ)充表1）噪馏。
使用 snRNA-seq 17和集成的質(zhì)量控制管道（參見 方法），我們生成了一個(gè)肺圖譜绿饵，其中包含 116,314 個(gè)細(xì)胞核欠肾，其中 79,636 個(gè)來自 COVID-19 感染的肺，36,678 個(gè)來自對照肺（圖1a）拟赊。我們使用三管齊下的方法進(jìn)行細(xì)胞類型識別：聚類標(biāo)記的無偏識別刺桃、使用來自報(bào)告圖譜的特征發(fā)現(xiàn)細(xì)胞類型，以及使用專家知識手動管理以對細(xì)胞群和細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行細(xì)分（參見 方法）吸祟。我們報(bào)告了三個(gè)粒度級別的細(xì)胞類型分配：主要細(xì)胞類型瑟慈、中間粒度和細(xì)粒度（補(bǔ)充表2）桃移。我們使用UMAP（圖1b、c葛碧、擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1b-d）來可視化降維數(shù)據(jù)借杰。我們確定了九種主要細(xì)胞類型：上皮細(xì)胞 ( n = 30,070 個(gè)細(xì)胞)、髓細(xì)胞 ( n = 29,632)进泼、成纖維細(xì)胞 ( n = 22,909)蔗衡、內(nèi)皮細(xì)胞 ( n = 5,386)、T 和自然殺傷 (NK) 淋巴細(xì)胞（n = 16,751)缘琅、B 淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞 ( n = 7,236)粘都、神經(jīng)元細(xì)胞 ( n = 2,017)、肥大細(xì)胞 ( n = 1,464) 和抗原呈遞細(xì)胞 (APC刷袍；主要是樹突細(xì)胞) ( n = 849）。在最細(xì)粒度的水平上樊展，我們確定了 41 種不同的細(xì)胞類型（補(bǔ)充表2）呻纹。
圖 1：研究設(shè)計(jì)和細(xì)胞景觀
a，研究設(shè)計(jì)概述专缠。b雷酪，UMAP 中的主要簇和各自的細(xì)胞類型分配。c涝婉，與b 中嵌入相同的細(xì)胞的起源哥力。d，對照（n = 7）和 COVID-19 肺（n = 19）中主要細(xì)胞類型的比例墩弯。中線吩跋，中位數(shù)；框邊緣渔工，第 25 個(gè)和第 75 個(gè)百分位數(shù)锌钮；胡須，不超過 ±1.5 × 四分位距 (IQR) 的最極端點(diǎn)引矩。Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)梁丘。
我們發(fā)現(xiàn) COVID-19 和對照肺之間的細(xì)胞分?jǐn)?shù)在全局（圖1d）和免疫區(qū)室和非免疫區(qū)室（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖2a-c）之間存在顯著差異。由于肺泡 II 型 (AT2) 和 I 型 (AT1) 細(xì)胞的丟失旺韭，以及單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞氛谜、成纖維細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞的增加，上皮細(xì)胞區(qū)室減少区端；這些觀察結(jié)果與供體性別無關(guān)（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3a值漫、b）。
我們發(fā)現(xiàn)COVID-19 和對照肺之間的ACE2珊燎、CD147（也稱為BSG）惭嚣、NPR1遵湖、TMPRSS2、FURIN或CTSL的表達(dá)沒有重大差異（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3c-f）晚吞。這表明細(xì)胞類型比例的變化與對病毒進(jìn)入很重要的受體或假定蛋白酶的表達(dá)無關(guān)延旧，盡管我們不能排除病毒介導(dǎo)的細(xì)胞死亡選擇性消耗這些基因高表達(dá)的細(xì)胞的可能性。我們在兩名患者（補(bǔ)充表3）中檢測到 SARS-CoV-2 讀數(shù)槽地，其中一名患有 HIV/AIDS（CD4 +入院時(shí)T 細(xì)胞計(jì)數(shù) 29/mm 迁沫；在 28 個(gè)細(xì)胞中檢測到 662 個(gè)獨(dú)特的分子標(biāo)識符），這表明原則上可以捕獲病毒讀數(shù)捌蚊。
髓樣細(xì)胞的異常激活
髓樣細(xì)胞代表了COVID-19肺中的主要細(xì)胞成分集畅，而且比對照肺（圖更普遍有1D，擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖2的A缅糟，C挺智，圖4a）。我們鑒定了單核細(xì)胞 ( n = 3,176)窗宦、單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞 (MDMs; n = 9,534)赦颇、過渡 MDMs ( n = 4,203) 和常駐肺泡巨噬細(xì)胞 (AMs; n = 12,511)，它們作為擴(kuò)散成分的不同軌跡被回收（DC）分析和COVID-19肺（圖更頻繁2a-c中赴涵，擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖4B-I媒怯，補(bǔ)充表2，4髓窜，5）扇苞。來自 COVID-19 患者的骨髓細(xì)胞被高度異常激活。例如寄纵，COVID-19 肺中的 MDM 差異表達(dá)激活基因（例如CTSB鳖敷、CTSD、CTSZ擂啥、PSAP）和兩種長鏈非編碼 RNA哄陶，NEAT1和MALAT1，它們與巨噬細(xì)胞異常激活和 T 細(xì)胞免疫受損相關(guān)18（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖5a哺壶，補(bǔ)充表5）屋吨。AMs 由胎兒單核細(xì)胞產(chǎn)生并可以自我更新19，在 COVID-19 肺中富集和高度激活（圖2c山宾，擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖5a））至扰。值得注意的是，COVID-19 AM 顯示出腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞受體 AXL 的 mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)強(qiáng)烈降低（圖2d资锰，擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖5b敢课、c），這是一種受體酪氨酸激酶，對于協(xié)調(diào)清除凋亡細(xì)胞（胞吞作用）很重要) 和隨后的組織再生過程中的抗炎調(diào)節(jié)20直秆。這些數(shù)據(jù)表明濒募，髓樣細(xì)胞是 COVID-19 炎癥失調(diào)的主要來源。
圖 2：COVID-19 中的免疫反應(yīng)
a圾结，突出免疫細(xì)胞簇的UMAP投影瑰剃。b，使用前三個(gè) DC 可視化髓樣細(xì)胞筝野。插圖表示組分配晌姚。c，對照（n = 7）和 COVID-19 肺（n = 19）的髓樣細(xì)胞分?jǐn)?shù)歇竟。中線挥唠，中位數(shù)；框邊緣焕议，第 25 個(gè)和第 75 個(gè)百分位數(shù)宝磨；晶須：不超過±1.5 × IQR 的最極端點(diǎn)。Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)盅安。d懊烤。對照和 COVID-19 肺組織中 CD169、AXL 和 DAPI（大圖）的代表性免疫熒光染色宽堆；頂部，帶有疊加層的選定區(qū)域茸习；底部畜隶，個(gè)人頻道。比例尺号胚，20 微米籽慢。e , f , Top 20 經(jīng)常檢測到的IGHV –COVID -19 ( e ) 中的IGLV組合和相應(yīng)的組注釋 (f )。先前描述的抗 RBD 抗體的組合21猫胁。g箱亿，T/NK細(xì)胞的UMAP；插圖弃秆，小組作業(yè)届惋。h，i菠赚，GZMB ( h ) 和MKI67 ( i ) 在與g相同的嵌入中的RNA 表達(dá)（對數(shù)歸一化）脑豹。
血漿和 T 細(xì)胞反應(yīng)
為了深入了解肺中針對 SARS-CoV-2 感染的體液免疫，我們基于每個(gè)細(xì)胞的鏈和同種型, 通過確定可變重 ( IGHV ) 和輕 ( IGLV ) 的mRNA 共表達(dá)來鑒定漿細(xì)胞并重建免疫球蛋白（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖6a-c）（參見 方法衡查；擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖6d-k瘩欺，補(bǔ)充表6）。IGHV1-18–IGLV3-20產(chǎn)生針對 SARS-CoV-2 刺突蛋白的受體結(jié)合域 (RBD) 的中和抗體 (S309)21，是常見的IGHV–IGLV 之一組合俱饿，這表明發(fā)生了協(xié)調(diào)的抗體反應(yīng)（圖2e歌粥，f，擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖6l拍埠，m）失驶。在 T/NK 細(xì)胞簇（圖2g）中，我們區(qū)分了 CD8 + T 細(xì)胞（n = 3,561）械拍、T 調(diào)節(jié)（T reg）細(xì)胞（n = 649）突勇、其他 CD4 + T 細(xì)胞（n = 7,586）和NK 細(xì)胞 ( n = 2,141)。我們發(fā)現(xiàn) COVID-19 肺中 T 細(xì)胞豐度沒有顯著增加坷虑，只有與 T 細(xì)胞活化和組織駐留相關(guān)的細(xì)胞因子和程序適度上調(diào)（圖2g-i甲馋，擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖7a-i））。盡管免疫反應(yīng)模式變化很大（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖7j迄损，k）定躏，但這些數(shù)據(jù)表明，在主要保留的體液免疫反應(yīng)的背景下芹敌，受損的 T 細(xì)胞反應(yīng)可能會導(dǎo)致 COVID-19 的致死結(jié)果痊远。
肺泡上皮再生受損
在上皮區(qū)室中，我們確定了肺泡上皮細(xì)胞（AT1 和 AT2 細(xì)胞氏捞；n = 20,949）碧聪、氣道上皮細(xì)胞（基底細(xì)胞、纖毛細(xì)胞液茎、棒狀細(xì)胞逞姿、杯狀細(xì)胞和粘液細(xì)胞；n = 7,223）捆等，這是一個(gè)以炎癥表達(dá)為特征的簇和細(xì)胞周期基因滞造，包括IRF8、B2M栋烤、MKI67和TOP2A（循環(huán)上皮谒养；n = 609），以及一個(gè)顯示細(xì)胞外基質(zhì) (ECM) 成分COL6A3明郭、COL1A2和COL3A1（ECM高上皮）高表達(dá)的簇; n= 1,179) (圖3a, b买窟，擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖8A-C，補(bǔ)充表2达址，7）蔑祟。
圖 3：肺再生受損和炎癥來源
a、b沉唠、研究的肺泡和氣道上皮細(xì)胞的 UMAP ( a ) 和相應(yīng)的組分配 ( b )疆虚。c，來自 COVID-19 和對照肺的 AT1 和 AT2 細(xì)胞的差異基因表達(dá)（對數(shù)歸一化，縮放径簿；參見 方法）罢屈。列，單個(gè)單元格篇亭；行缠捌，最高調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。左欄译蒂，AT1（紫色）和 AT2（粉色）細(xì)胞的譜系標(biāo)記曼月。顏色編碼的頂部泳道表示簽名的表達(dá)強(qiáng)度（對數(shù)歸一化；參見 方法）和組分配柔昼，如右側(cè)所示哑芹。exp.，表達(dá)捕透。d , e , ETV5和CAV1 的小提琴圖分別在 AT2 和 AT1 細(xì)胞中的 mRNA 表達(dá)（對數(shù)歸一化）聪姿；帶有 Bonferroni 校正的 Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)。f乙嘀，UMAP嵌入AT1和AT2細(xì)胞并鑒定DATP末购；插圖表示小組分配。g虎谢，AT1和AT2細(xì)胞中DATP特征表達(dá)（對數(shù)歸一化）的小提琴圖盟榴。Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)。h婴噩，前三個(gè) DC 顯示了 AT2 和 AT1 細(xì)胞和 DATP 的主要軌跡曹货、DATP 特征的表達(dá)和組分配（插圖）。i讳推，對照 ( n = 7) 和 COVID-19 肺 ( n = 19)中 DATP 和 AT 細(xì)胞的比例。中線玩般，中位數(shù)银觅；框邊緣，第 25 個(gè)和第 75 個(gè)百分位數(shù)坏为；晶須究驴，不超過 ±1.5 × IQR 的最極端點(diǎn)。Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)匀伏。j洒忧，對照和 COVID-19 肺組織中 pro-SPC、KRT8 和 DAPI 的代表性免疫熒光染色够颠；頂部熙侍，具有覆蓋的代表性區(qū)域；底部，帶有選定區(qū)域各個(gè)通道的小圖像蛉抓。比例尺庆尘，50 微米。k , l巷送，健康肺組織中 IL-1β ( k ) 和 IL-6 ( l ) 的組織質(zhì)量細(xì)胞計(jì)數(shù)定量驶忌，以及來自具有不同感染病因的供體的樣本。每個(gè)點(diǎn)代表感興趣區(qū)域 (ROI) 中 IL-1β 和 IL-6 的量化笑跛；帶有 Benjamini-Hochberg 錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率 (FDR) 調(diào)整的雙邊 Mann-Whitney U檢驗(yàn)付魔。
AT2 細(xì)胞在肺再生22期間充當(dāng) AT1 細(xì)胞的祖細(xì)胞。對照肺中的 AT2 和 T1 細(xì)胞形成不同的簇（圖3a飞蹂、b）并證明了差異基因表達(dá) (DGE) 分析的預(yù)期變化几苍，包括AT2 細(xì)胞中譜系標(biāo)記SFTPC和SFTPB的表達(dá)，以及AT1 中的CLIC5和AGER細(xì)胞（圖3c晤柄，補(bǔ)充表7）擦剑。相比之下，COVID-19 肺中 AT2 和 AT1 細(xì)胞的聚類不那么離散芥颈，很大一部分細(xì)胞不與其對照對應(yīng)物重疊（圖3b））惠勒。來自 COVID-19 肺的 AT2 和 AT1 細(xì)胞均顯示出定義標(biāo)志物的整體表達(dá)降低（圖3c）。COVID-19 AT2 細(xì)胞顯示ETV5表達(dá)降低（圖3d）爬坑，這是一種維持 AT2 細(xì)胞身份所需的轉(zhuǎn)錄因子纠屋。降低的ETV5表達(dá)與向 AT1 細(xì)胞的分化相關(guān)23，表明 AT2 細(xì)胞已啟動再生程序（圖3d盾计，擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖8d）售担。CAV1是 AT1 晚期成熟的標(biāo)志物24，在來自 COVID-19 肺的 AT1 細(xì)胞中以顯著較低的水平表達(dá)（圖3e））署辉∽迕總體而言，這些數(shù)據(jù)表明 COVID-19 肺中 AT2 到 AT1 細(xì)胞的轉(zhuǎn)化不完全哭尝。
最近的研究表明哥攘，炎癥可以誘導(dǎo)細(xì)胞狀態(tài)，其特征是不能完全轉(zhuǎn)變?yōu)?AT1 細(xì)胞材鹦；這已被稱為“損傷相關(guān)瞬態(tài)祖細(xì)胞”（DATPs）逝淹，“肺泡分化中間”（ADI），或“預(yù)AT1移行細(xì)胞狀態(tài)”（PATS）25桶唐，26栅葡，27（以下簡稱為DATPs）。我們使用 DATP 標(biāo)記基因（KRT8尤泽、CLDN4和CDKN1A）25 的表達(dá)來開發(fā) DATP 特征（參見 方法欣簇；擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖8e-h规脸，補(bǔ)充表8）并發(fā)現(xiàn)來自 COVID-19 肺的肺泡上皮細(xì)胞在表達(dá)該特征方面的得分明顯高于來自對照肺的細(xì)胞（圖3f、g醉蚁，擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖8i）燃辖。DC 分析將主要軌跡從 AT2 分離到 AT1 細(xì)胞，而 DATP 主要位于 AT2 和 AT1 細(xì)胞之間（圖3h网棍，擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖8j-n）黔龟。與分化的 AT2 或 AT1 細(xì)胞相比，DATP 的基因集富集分析 (GSEA) 顯示 TNFα 和 p53 信號的富集滥玷，以及通過 HIF-1α 的缺氧反應(yīng)（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖8o）氏身，與 DATP 中涉及的途徑一致在小鼠模型中27. 與 p53 信號的過度表達(dá)一致，大多數(shù) DATP 沒有經(jīng)歷細(xì)胞分裂（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖8p）惑畴，表明它們在 DATP 細(xì)胞狀態(tài)中停滯蛋欣。
DATP 在 COVID-19 中比對照肺更頻繁（圖3i）。相應(yīng)組織的免疫熒光染色顯示 KRT8 +和 CLDN4 + DATP 在 COVID-19 肺中的頻率較高（圖3j如贷，擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖8r陷虎，s），我們觀察到隨著時(shí)間的推移杠袱，AT1 細(xì)胞豐度逐漸喪失尚猿。癥狀發(fā)作至死亡（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖8t）￠垢唬總體而言凿掂，這些數(shù)據(jù)表明，除了病毒感染直接破壞肺泡上皮外纹蝴，COVID-19 患者的肺再生過程也會受損庄萎。
我們接下來確定了導(dǎo)致 DATP 細(xì)胞狀態(tài)，更一般地說塘安，導(dǎo)致 COVID-19 肺部高炎癥環(huán)境的炎癥來源糠涛。在 mRNA 水平捕獲炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素 (IL)-1β（和其他）可能是有限的，因?yàn)?IL-1β 的生物活性形式在觸發(fā) DATP 中起主要作用25兼犯，是通過從 pro-IL 裂解產(chǎn)生的-1β 炎癥小體激活時(shí)脱羡；因此，蛋白質(zhì)水平評估提供了補(bǔ)充信息免都。為此，我們利用了最近發(fā)布的高分辨率成像質(zhì)量細(xì)胞計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)集帆竹，該數(shù)據(jù)集對來自 23 個(gè)個(gè)體（包括健康對照）的 237 個(gè)組織區(qū)域進(jìn)行了分析绕娘；流感肺炎、細(xì)菌性肺炎或ARDS患者栽连；和 10 名死于 COVID-19 的患者28. IL-1β 在 COVID-19 患者的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中的表達(dá)比健康個(gè)體或其他疾病組的患者更強(qiáng)（圖3k险领，擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖9a-c）侨舆。IL-6 是 COVID-19 病理生理學(xué)中調(diào)用的另一種關(guān)鍵炎癥細(xì)胞因子，它在 COVID-19 患者的上皮細(xì)胞中更豐富绢陌，但與其他疾病組的患者相比挨下，這些患者的巨噬細(xì)胞中沒有差異表達(dá)（圖 1）。3l脐湾，擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖9d-f）臭笆。最后热芹，我們發(fā)現(xiàn) COVID-19 患者的 I 型干擾素和干擾素反應(yīng)基因在各種細(xì)胞類型（包括 AT2 細(xì)胞渤昌、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）中的表達(dá)強(qiáng)于對照供體（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖9g、h） . 總之蒙兰，這些數(shù)據(jù)表明闻鉴，與其他病毒性或細(xì)菌性肺炎相比茵乱，髓源性 IL-1β 可能是 COVID-19 的一個(gè)顯著特征，并且可能有助于誘導(dǎo)和維持 DATP 細(xì)胞狀態(tài)孟岛。
COVID-19 中的異位簇狀細(xì)胞
中捕獲的氣道上皮細(xì)胞瓶竭，我們回收四個(gè)不同的軌跡：KRT5+TP63+基底（? = 534），俱樂部（? = 1232）渠羞，和杯狀細(xì)胞（? = 1757）斤贰，和一個(gè)軌跡具有較少細(xì)胞（? = 110）這主要在 COVID-19 肺中發(fā)現(xiàn)，我們將其確定為推定的簇狀細(xì)胞（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖10a-e）堵未。簇狀細(xì)胞參與氣道炎癥和腸組織再生29腋舌，但它們在病毒性肺炎中的作用仍不清楚。簇絨單元的數(shù)量（CHAT +或 POU2F3 +) 在 COVID-19 患者的上呼吸道中增加了三倍渗蟹，并且它們異位存在于 COVID-19 的肺實(shí)質(zhì)中块饺，但不存在于對照肺中（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖10f-k）。為了開始闡明簇狀細(xì)胞在病毒性肺炎中的假定作用雌芽，我們用 PR8（一種實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)的 H1N1 流感病毒株）感染了缺乏簇狀細(xì)胞的野生型和Pou2f3-/-小鼠（參見 方法）授艰。與對照相比，Pou2f3-/-小鼠的肺顯示巨噬細(xì)胞浸潤減少和趨化基因（包括Ccl3和Ccl8) 也參與將髓細(xì)胞募集到死于 COVID-19 的個(gè)體的肺部（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖9 g世落、h淮腾、11a-l）。盡管需要進(jìn)一步研究它們的作用屉佳，但這些異位簇狀細(xì)胞可能有助于 COVID-19 的病理生理學(xué)（補(bǔ)充討論）谷朝。
病理性成纖維細(xì)胞和肺纖維化
COVID-19肺中的成纖維細(xì)胞明顯多于對照肺（圖1d）；α-平滑肌肌動蛋白 (α-SMA) 的免疫組織化學(xué)染色證實(shí)了這一發(fā)現(xiàn)（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖12a-d）武花。纖維化程度（由 Sirius red 纖維化評分確定圆凰，參見 方法）與疾病持續(xù)時(shí)間相關(guān)（圖4a），表明 COVID-19 中肺纖維化隨時(shí)間增加体箕。我們確定了五種成纖維細(xì)胞亞型：肺泡 ( n = 4,670)专钉、外膜 ( n = 3,773)挑童、病理性 ( n = 2,322)、中間病理性 ( n = 8,779) 和其他 ( n = 1,099)（圖4b）, 擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖12e )跃须。成纖維細(xì)胞簇差異的主要驅(qū)動因素是與對照肺相比站叼，COVID-19 肺中病理或中間病理成纖維細(xì)胞（以下統(tǒng)稱為 pFB）的頻率增加（圖4c，擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖12f）菇民。pFB 強(qiáng)烈表達(dá)*****CTHRC1*****尽楔，這是最近描述的定義這些細(xì)胞的標(biāo)志基因，以及病理性 ECM 3 基因玉雾，包括COL1A1和COL3A1（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖12e翔试，補(bǔ)充表9）。在小鼠模型和特發(fā)性肺纖維化 (IPF) 或硬皮病3患者中复旬，pFB 是肺纖維化的關(guān)鍵驅(qū)動因素垦缅。它們增加的頻率表明 pFB 促進(jìn)了 COVID-19 患者快速發(fā)展的肺纖維化。**
圖 4：COVID-19 中的病理性成纖維細(xì)胞和隨后的纖維化驹碍。
a壁涎，COVID-19 樣本（n = 16，參見 方法）中從癥狀出現(xiàn)到死亡和纖維化評分的天數(shù)測定系數(shù) ( R 2 )志秃。誤差帶怔球，皮爾遜相關(guān)性的 95% se 間隔。b浮还，成纖維細(xì)胞（FB）亞群的 UMAP竟坛；插圖表示小組分配。path., 病態(tài)的钧舌。c担汤，對照（n = 7）和COVID-19肺（n = 19）的所有成纖維細(xì)胞中病理成纖維細(xì)胞的分?jǐn)?shù)。中線洼冻，中位數(shù)崭歧；框邊緣，第 25 個(gè)和第 75 個(gè)百分位數(shù)撞牢；晶須率碾，不超過 ±1.5 × IQR 的最極端點(diǎn)。Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)屋彪。
鑒于成纖維細(xì)胞在肺生態(tài)系統(tǒng)重塑中的重要性所宰，我們接下來研究了所有主要細(xì)胞類型（包括成纖維細(xì)胞）的配體 - 受體相互作用（參見 方法）。在所有細(xì)胞中豐富的推斷配體 - 受體相互作用中有 TGFβ1-TGFβ 受體 2 和 BMP6-ACVR1（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖12g-i畜挥，補(bǔ)充表 10）仔粥，它們分別屬于 TGFβ 家族和超家族。TGFβ 信號傳導(dǎo)在促進(jìn)肺纖維化方面具有重要作用砰嘁，并且與成纖維細(xì)胞介導(dǎo)的 ADI 維持有關(guān)27件炉，這與 DATP 細(xì)胞狀態(tài)密切相關(guān)。為了研究針對 pFB 的潛在治療策略矮湘，我們從單核轉(zhuǎn)錄組推斷蛋白質(zhì)活性斟冕，然后將 pFB 與其他成纖維細(xì)胞進(jìn)行比較。該分析預(yù)測 pFB 將顯示 JunB 和 JunD 的活性增加（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖12j缅阳，補(bǔ)充表 11）磕蛇，它們通過增強(qiáng)的 TGFβ 和 STAT3 信號在小鼠模型中誘導(dǎo)肺纖維化，并與增加的 IL-1β 產(chǎn)生相關(guān)30十办。最后秀撇，我們推斷了 pFB 中的可成藥靶標(biāo)（參見 方法），并將 MMP14 和 STAT3 確定為取消 pFB 中有害程序的潛在靶標(biāo)（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖12j向族，補(bǔ)充表 11 )呵燕。
討論
我們使用短 PMI 尸檢標(biāo)本和對照肺樣本生成了 COVID-19 的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組肺圖譜。我們的分析提供了對致命 COVID-19 的細(xì)胞景觀件相、細(xì)胞程序和細(xì)胞回路的廣泛普查再扭。蛋白質(zhì)活性和細(xì)胞間相互作用的額外推斷，以及使用成像質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析各種細(xì)胞類型的炎性細(xì)胞因子夜矗，為 SARS-CoV-2 感染肺部的有害后果提供了一個(gè)詳細(xì)的視角泛范。
我們的分析表明，產(chǎn)生 IL-1β 的異常激活的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞之間存在相互作用紊撕，炎癥誘導(dǎo)的肺泡上皮再生受損罢荡，以及促進(jìn)纖維化并可能損害再生的病理性成纖維細(xì)胞的擴(kuò)增（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖12f，k对扶，補(bǔ)充討論）区赵。除了這些有害事件外，我們的數(shù)據(jù)表明辩稽，盡管可能存在足夠的體液免疫反應(yīng)（補(bǔ)充討論）惧笛，但死于 COVID-19 的個(gè)體肺部 T 細(xì)胞反應(yīng)不足。最近的一項(xiàng)研究表明逞泄，感染 COVID-19 的癌癥患者的 B 細(xì)胞功能受損與死亡率增加無關(guān)31患整，但缺乏足夠的 CD8+ T 細(xì)胞反應(yīng)（即使存在足夠的體液免疫）與較差的病毒控制和增加的死亡率有關(guān)31。盡管我們的 COVID-19 隊(duì)列不包括癌癥患者喷众，但這些數(shù)據(jù)表明各谚，雖然在針對 SARS-CoV-2 的 T 細(xì)胞免疫充足的情況下，體液免疫可能是可有可無的到千，但我們的患者可能缺乏適當(dāng)?shù)?T 細(xì)胞反應(yīng)導(dǎo)致了致命的后果昌渤。
盡管我們的研究深入了解了宿主對致命 SARS-CoV-2 感染的反應(yīng)，但它受到樣本量較小的限制憔四。然而膀息，通過協(xié)調(diào)努力般眉，我們的工作將為一系列研究做出貢獻(xiàn)，包括 TM Delorey 等人的配套論文潜支。32甸赃，具有簡化的協(xié)議和統(tǒng)一的元數(shù)據(jù)，以實(shí)現(xiàn)集成和組合分析冗酿，并將有助于解釋重要的協(xié)變量埠对。此外，由于我們的分析側(cè)重于死于 COVID-19 的患者的肺組織裁替，因此我們僅檢查了潛在疾病表型的一個(gè)子集项玛。盡管如此，一些觀察結(jié)果弱判，例如肺纖維化的快速發(fā)展（補(bǔ)充討論）)襟沮，可能與從嚴(yán)重 COVID-19 中幸存下來的患者相關(guān)，并可能讓我們了解這些人33的長期并發(fā)癥裕循。
總之臣嚣，我們從短 PMI 組織標(biāo)本中生成了分子單細(xì)胞肺圖譜，并確定了致命的 COVID-19 的病理回路剥哑。該圖譜為研究宿主對 SARS-CoV-2 的反應(yīng)和了解 COVID-19 引起的潛在長期肺部后遺癥建立了重要資源硅则，并為嚴(yán)重疾病的治療開發(fā)提供了基礎(chǔ)。
