作者：二十八畫生
審稿：童蒙
編輯：amethyst

引言

經(jīng)常看到類似的提問：轉(zhuǎn)錄組測序分析中FPKM和TPM哪個歸一化方法好码荔？小編并不盲從漩勤，此前一直使用FPKM，Nature缩搅、Science和Cell文章都能看到FPKM的身影越败。不過小編最近對轉(zhuǎn)錄組定量歸一化方法有了新的認(rèn)識，借此機會同大家分享幾種歸一化方法的異同和分析工具硼瓣。

目前究飞，轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）分析是非常成熟的研究手段，有眾多分析工具和方法供大家使用堂鲤，其中亿傅，對基因或轉(zhuǎn)錄本的讀段數(shù)目（read count）進(jìn)行歸一化是一個非常重要的分析過程，如何對基因區(qū)域進(jìn)行準(zhǔn)確的定量和歸一化瘟栖，是大家十分關(guān)心的核心問題之一葵擎。

無疑，轉(zhuǎn)錄組測序雙端數(shù)據(jù)分析中半哟，目前FPKM是最常用的歸一化方法酬滤，那FPKM歸一化方法是最準(zhǔn)確的嗎？隨著生物信息分析技術(shù)的快速發(fā)展寓涨，F(xiàn)PKM或許已經(jīng)是“明日黃花”盯串。

1.歸一化的基本背景

總的來說，傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄組定量方法是相對定量戒良，一個基因的定量結(jié)果很大程度上會受到基因的長度和測序深度的影響体捏。基因長度越長、測序深度越高译打，得到該基因的read counts就越多，相對表達(dá)水平也越高拇颅。所以奏司，在進(jìn)行下游分析的時候，例如聚類樟插、主成分分析韵洋，如果不進(jìn)行數(shù)據(jù)歸一化直接使用原始read count，簡直就是耍流氓黄锤。

因此搪缨，表達(dá)量歸一化的精確計算需要同時考慮基因長度、測序深度等信息鸵熟。

2.歸一化方法的異同

下表列舉了不同組學(xué)數(shù)據(jù)分析的歸一化方法：

早期副编，RNA-seq測序為單端測序，一般使用最為經(jīng)典的RPKM（Reads Per Kilobase Million）進(jìn)行數(shù)據(jù)歸一化流强，儼然轉(zhuǎn)錄組歸一化界的老大哥痹届，不僅在轉(zhuǎn)錄組領(lǐng)域占有一席之地，而且在表觀數(shù)據(jù)歸一化方面也有較為廣泛的應(yīng)用打月；而當(dāng)前FPKM作為最常用的雙端數(shù)據(jù)歸一化方法走向了臺前队腐，F(xiàn)PKM兼顧了基因的長度和深度信息使得數(shù)據(jù)歸一化更為準(zhǔn)確。

RPKM公式如下：

其中奏篙，nr是比對到基因的read counts; L是基因的外顯子長度之和除以1000柴淘；N是總有效比對到基因組的read counts。

FPKM公式如下：

其中秘通，nf是比對到基因的插入片段數(shù)目为严，其余參數(shù)與RPKM一致。

然而充易，金無足赤梗脾，作為老戲骨的FPKM有一個明顯的缺點是不同樣本/批次數(shù)據(jù)的歸一化數(shù)值總和不一致，那么在進(jìn)行下游分析時就會出現(xiàn)問題盹靴。

小鮮肉兒炸茧，TPM（Transcripts Per Million）正是為了解決該問題而生。為了保證比較組樣本間的歸一化數(shù)值總和相同稿静，即TPM總和為1M梭冠，所以可以直接TPM對樣本進(jìn)行比較，定量效果更為理想改备，總而言之TPM并非靠臉吃飯控漠。

TPM公式如下：

Ni為比對到第i個exon的reads數(shù)目；Li為第i個exon的長度；sum(N1/L1+N2/L2 + ... + Nn/Ln)為所有 (n個)exon按長度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化之后數(shù)值之和盐捷。

由于基因長度和轉(zhuǎn)錄本豐度各異偶翅，RPKM和FPKM直接使用read counts或fragment counts會對歸一化帶來偏差，TPM之所以更加有效是因為碉渡，它不是直接除以有效比對的read counts總數(shù)聚谁，而是除以經(jīng)過基因長度歸一化后的read counts總數(shù)，故使用TPM對定量歸一化更加合理和科學(xué)滞诺。

既然TPM更加優(yōu)秀形导，那么眾多科研工作者還在普遍使用RPKM/FPKM歸一化方法呢，主要原因有：

• 1. TPM和FPKM存在正相關(guān)性习霹，且RPKM/FPKM在一定程度上符合實驗的驗證結(jié)果朵耕，包括公式提出者和科研工作者在內(nèi)都能得到比較理想的驗證結(jié)果；
• 2. 大家都這么用淋叶，相關(guān)的文章很普遍的使用RPKM或FPKM阎曹，定量方法沒有翻天覆地的變化，沒有意識到定量與生物學(xué)問題直接的聯(lián)系煞檩。

3.如何計算TPM值

通常芬膝，定量之前需要利用二代數(shù)據(jù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本的組裝，常用的軟件有Cufflinks和StringTie形娇；如果有參考基因組測序reads可以直接進(jìn)行比對和定量以及歸一化锰霜，如RSEM和eXpress軟件。

當(dāng)然還有不依賴于參考基因組比對后組裝的軟件桐早，直接使用reads進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本組裝定量癣缅，如Sailfish、Salmon哄酝、quasi-mapping和kallisto友存。

以上具體軟件的使用和適用條件，大家可自行閱讀參考資料5對應(yīng)的良心文章陶衅。

TPM值簡要計算思路如下：

1. 計算read count

   使用HTSeq-count或featureCounts計算各個基因區(qū)間的read counts屡立，二者計算count值差別不大，且后者速度較快搀军，推薦使用膨俐。

2. 原始read count校正、加和

   norm_read_count = read_count / (gene_length / 1000)

   全部校正后的read count數(shù)值加和罩句，得到total_read_count

3. 計算TPM值

   TPM = read_count * 1000 * 1000000 / (gene_length * total_read_count)

   至此焚刺，就得到了一個基因的歸一化的read count數(shù)值。

4.差異表達(dá)分析

既然TPM歸一化方法更好门烂，是不是要采用TPM數(shù)值作為輸入來進(jìn)行差異表達(dá)分析呢乳愉？

其實兄淫，現(xiàn)有的差異分析軟件往往并不支持歸一化的數(shù)據(jù)作為輸入來進(jìn)行差異比較，幾乎所有軟件都使用raw read count作為輸入蔓姚，內(nèi)部進(jìn)行歸一化和統(tǒng)計檢驗捕虽。常用的差異表達(dá)分析軟件有基于read count的DESeq2、limma坡脐、edgeR薯鳍，和基于轉(zhuǎn)錄本組裝的Cuffdiff、Ballgown或sleuth挨措。

回到剛才的問題，TPM是對單個樣本在組內(nèi)進(jìn)行的歸一化崩溪，差異分析是尋找不同樣本之前相同基因的表達(dá)差異浅役，不是同一個層面的問題。歸一化后的數(shù)據(jù)集更為集中伶唯、數(shù)值變小觉既，導(dǎo)致樣本間的差異本身被人為縮小，很可能帶來沒有差異表達(dá)基因的后果乳幸，導(dǎo)致錯誤的分析方法瞪讼。

另外，比較不同樣本間同一基因的read count只需要平行比較組間的數(shù)據(jù)即可粹断，不需要考慮基因長度的影響符欠，也不需要對單個樣本內(nèi)的數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化。

5.TPM的缺陷

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)定量歸一化方法有很多瓶埋，經(jīng)典的RPKM/FPKM因其本身固有的缺陷希柿，越來越多的學(xué)者采用TPM這一冉冉升起的新星，大有取而代之的勢頭养筒。

其實曾撤，不管TPM、RPKM還是FPKM都是相對定量的歸一化方法晕粪。定量的前提需要樣本的表達(dá)量變化比較穩(wěn)定挤悉，不能出現(xiàn)整體的上調(diào)或下調(diào)，或者個別基因表達(dá)量發(fā)生劇烈變化巫湘，否則定量歸一化方法可能會失效装悲。

另外，傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組測序在信息分析過程中通常不會去除duplicate reads尚氛，因為根本不知道這些reads是多個表達(dá)拷貝的結(jié)果衅斩，還是文庫構(gòu)建中PCR duplication產(chǎn)生的結(jié)果。為了在源頭實現(xiàn)精確定量怠褐，可以在reads中追加序列唯一的UMI（Unique Melocular Identifier）分子標(biāo)簽畏梆，這樣攜帶相同UMI標(biāo)簽的reads認(rèn)為是duplicate reads，保留一條質(zhì)量值最高的read即可，從而實現(xiàn)較為準(zhǔn)確的絕對定量奠涌。

6.如何實現(xiàn)絕對定量

轉(zhuǎn)錄組測序的終極目的是基于表達(dá)量來發(fā)掘背后的生物學(xué)問題宪巨，問題是表達(dá)量真的準(zhǔn)確嗎？

序列偏好溜畅、cDNA反轉(zhuǎn)錄捏卓、文庫PCR擴增、測序擴增等都會增加解讀數(shù)據(jù)的難度慈格。如何解釋常規(guī)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)面需要解決的問題比較多怠晴，不僅僅是定量這一個方面。

忽如一夜春風(fēng)來浴捆，最近各個科服大廠都在討論轉(zhuǎn)錄組UMI定量的事情蒜田。UMI正如火如荼的使用在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的研究中，同時整合barcode选泻、UMI信息對單細(xì)胞數(shù)據(jù)進(jìn)行解讀冲粤。

早在2012年，關(guān)于digital轉(zhuǎn)錄組UMI定量的文章就已發(fā)表页眯，作者系統(tǒng)的討論了UMI或barcode序列的設(shè)計思路梯捕、性能驗證等工作∥涯欤總之傀顾，UMI定量更加準(zhǔn)確、測序序列可以相互校正從而提高序列準(zhǔn)確性碌奉，更重要的是對于低拷貝轉(zhuǎn)錄本的定量也更為準(zhǔn)確锣笨。

建庫定量示意圖如下：

基于二代測序免不了進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本組裝，組裝過程可能引入組裝錯誤或剪切體的丟失道批。而三代測序所測即所得的特點則不存在上述問題的困擾错英，與UMI/barcode相結(jié)合不失為一種更高效的思路，以市面上比較流行的PacBio三代測序平臺為例隆豹，在克服轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)出低椭岩、片段選擇等問題后其轉(zhuǎn)錄本準(zhǔn)確定量則水到渠成。

名詞術(shù)語

1. RPKM: Reads Per Kilobase Million
2. FPKM: Fragments Per Kilobase Million
3. TPM: Transcripts Per Millon
4. RPM: Reads Per Millon
5. RPGC: Reads Per Genomic Content, defined as total number of mapped reads * fragment length) / effective genome size
6. BPM (per bin): number of reads per bin / sum of all reads per bin (in millions)
7. SRPBM: Spliced Reads per Billion Mapping, defined as number of circular reads / (number of mapped reads * read length )
8. fragment: region between read1 and read2
9. UMI: Unique Melocular Identifier

參考資料

1. Ali Mortazavi et al. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature Methods, 2008
2. http://www.rna-seqblog.com/rpkm-fpkm-and-tpm-clearly-explained/
3. Bo Li, et al. RNA-Seq gene expression estimation with read mapping uncertainty. Bioinformatics, 2010
4. https://haroldpimentel.wordpress.com/2014/05/08/what-the-fpkm-a-review-rna-seq-expression-units/
5. Sahraeian, S.M.E. et al. Gaining comprehensive biological insight into the transcriptome by performing a broad-spectrum RNA-seq analysis. Nat Commun, 2017
6. https://bioinform.github.io/rnacocktail/
7. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/472571v2.full
8. Katsuyuki Shiroguchi et al .Digital RNA sequencing minimizes sequence-dependent bias and amplification noise with optimized single-molecule barcodes. PNAS, 2012